Google使用新技巧(z)众人所知，Google 是个很超好的 Search Engine搜索器。
但你知道吗，除了用Google 在网上搜索外，Google 还可以让你执行很多功能呢！
好。。让我一件一件的讲解吧！
1）上去 www.google.com
2) 键入任何数学题。
比如：
68787686 + 65676576 - 67876876
sin(pi/3)
sqrt(49）
3）按 Google Search
你看。。Google 会帮你计算任何的数学题哦！
连一些很深奥的也可以的，试试看吧！
我真的很佩服 Google 的 Engineer。
当你在搜索的时候，会不会搜索到一大堆不连关的结果呢？
想如何缩小搜索的范围吗？
比如说，我想要搜索有关 Microsoft Security 的文件。
若我就以 Microsoft Security 来搜索的话，可能会有一大堆与 Microsoft 没联系的结果。
那如何要在指定的网站上搜索呢？
很简单的，聪明的 Google 工程师早就为我们想好了办法！
就以 Microsoft Security 来做实范。
在 Google 搜索框中输入“security site:www.microsoft.com”。
Google 就会向指定的 www.microsoft.com 里寻找有关 Security 的文件。
我一直都是用Google的，
但是不知道它可以帮我算数。。。呵呵
在这里告诉你们一个有趣的事。嘿嘿~
在www.google.com里输入elgoog(google的相反)，
然后按search...
然后再进入所找到的网页。
你就会发现。。。
在几次的测试中，发现 Google 也能用来作 Conversion 的。
比如说，我要知道 54 square meter 等于多少 square feet ？
我就键入 54 square meter in square feet
如果想知道，1053564 kb 等于多少 megabytes， 那键入 103636 kb in MB。
要算出 234 inch 等于多少 cm 的话，键入 234 inch in cm。
在不用 Conversion table 下，就很轻易的计算出一些公式。
用 IE 的朋友一定是被微软在电脑里设定 MSN 搜索器吧？
那么，是否能够将Google作为默认的搜索页呢？
答案是肯定的，而且办法很简单。
在浏览器的地址栏输入 www.google.com/google.reg，按Enter，将Google.reg 保存电脑里。然后双击Google.reg 就行了。
从此 google 就成了 IE 的默认搜索器。
对 Linux 有兴趣的朋友，想找有关 Linux 方面的资料的话，
Google 有专为 Linux 提供的搜索器。
http://www.google.com/linux
BSD的则是http://www.google.com/bsd
Google（www.google.com）是一个搜索引擎，Yahoo和网易等均用Google作为搜索引擎。GOOGLE支持多达132种语言，包括简体中文和繁体中文；GOOGLE网站只提供搜索引擎功能，没有花里胡哨的累赘；GOOGLE速度极快；GOOGLE的专利网页级别技术 PageRank能够提供高命中率的搜索结果； GOOGLE的搜索结果摘录查询网页的含有关键字的内容，而不仅仅是网站简介；GOOGLE智能化的“手气不错”功能，提供可能最符合要求的网站； GOOGLE的“网页快照”功能，能从GOOGLE服务器里直接取出缓存的网页。
GOOGLE有四大功能模块：网站、图像、新闻组和目录服务。默认是网站搜索，用户可以灵活选择图象搜索、新闻组和目录服务。
1.基本搜索
逻辑符：与（+、空格）、或（OR）、非（-）。
*搜索包含几个关键词或几个关键词组合的网页信息，只需输入关键词和逻辑符。如搜索：
水稻 品种资源、 水稻 OR 品种资源、 水稻 品种资源 -野生稻 等等
*搜索包含整个词组或句子的网页信息，必须加英文引号。如搜索：
"中国水稻品种资源" 、"Crop Germplasm Resources" 等等
2.高级搜索
限制符：site、filetype、inurl。
*搜索包含特定（类）网站及关键词的网页信息，只需输入关键词、逻辑符和限制符。如搜索：
水稻 品种资源 site:edu.cn、 "水稻品种资源" site:icgr.caas.net.cn
水稻 filetype:pdf、 水稻 filetype:jpg
inurl:mp3
3.特殊搜索
*搜索所有链接到某个URL地址的网页。如搜索：
link:icgr.caas.net.cn
*查找与某个页面结构内容相似的页面。如搜索：
related:icgr.caas.net.cn/default.html
*查找与某链接相关的一些信息。如搜索：
info:icgr.caas.net.cn
4.搜索技巧
关键词的选择在搜索中起到决定性的作用，所有搜索技巧中，关键词选择是最基本也是最有效的。
例一：查找小麦的基本情况
分析：如果只用“小麦”做关键词，搜索结果将浩如烟海，没什么价值，因此必须要加更多的关键词，约束搜索结果。选择什么关键词好呢？可以猜到的是，类似的资料，应该包含诸如“小麦属”、“起源”、“原产”、“分布”等词汇。
搜索：小麦属 起源 分布
例二：找人
分析：一个人在网上揭示的资料通常有：姓名，性别，年龄，毕业学校，工作单位，电话，信箱，BP，手机号码等等。所以，如果你要了解一下你多年没见过的同学，那不妨用上述信息做关键字进行查询，也许会有大的收获。
例三：找软件
分析一：最简单的搜索当然就是直接以软件名称以及版本号为关键字查询。但是，仅仅有软件名称和目标网站，显然还不行，因为搜索到的可能是软件的相关新闻。应该再增加一个关键字。考虑到下载页面上常有“点击此处下载”或者“download”的提示语，因此，可以增加“下载”或者“download”为关键字。
搜索：winzip 8.0 下载
分析二：很多网站设有专门的下载目录，而且就命名为“download”，因此，可以用INURL语法直接搜索这些下载目录。
搜索：winzip 8.0 inurl:download
共享软件下载完之后，使用的时候，软件总跳出警示框，或者软件的功能受到一定限制，所以应该再找一个注册码。找注册码，除了软件的名称和版本号外，还需要有诸如“serial number”、“sn”、“序列号”等关键字。现在，来搜索一下winzip8.0的注册码。
搜索：winzip 8.0 sn
例四：找图片
除了GOOGLE提供的专门图片搜索功能，还可以组合使用一些搜索语法，达到图片搜索之目的。
分析一：专门的图片集合，提供图片的网站通常会把图片放在某个专门目录下，如“photo”、“image”等。这样就可以使用INURL语法迅速找到这类目录。现在，试着找找水稻的照片集。
搜索：rice inurl:photo
分析二：提供图片集合的网页，在标题栏内通常会注明，这是谁谁的图片集合。于是就可以用INTITLE语法找到这类网页。
搜索：intitle:rice picture
例五：找MP3
分析一：提供MP3的网站，通常会建立一个叫做MP3的目录，目录底下分门别类的存放各种MP3乐曲。所以，可以用INURL语法迅速找到这类目录。现在用这个办法找找老歌“say you say me”。
搜索："say you say me" inurl:mp3
分析二：也可以通过网页标题，找到这类提供MP3的网页。
搜索："say you say me" intitle:mp3 [印象派 (2-8 16:25, Long long ago)]
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sForum ][登录后回复]1楼
英文科研文章写作技巧a)如何指出当前研究的不足以及有目的地引导出自己的研究的重要性
通常在叙述了前人成果之后，用However来引导不足，比如
However, little information..
little attention...
little work...
little data
little research
or few studies
few investigations...
few researchers...
few attempts...
or no
none of these studies
has (have) been less
done on ...
focused on
attempted to
conducted
investigated
studied
(with respect to)
Previous research (studies, records) has (have)
failed to consider
ignored
misinterpreted
neglected to
overestimated, underestimated
misleaded
thus, these previus results are
inconclisive, misleading, unsatisfactory, questionable, controversial..
Uncertainties (discrepancies) still exist ...
这种引导一般提出一种新方法，或者一种新方向。如果研究的方法
以及方向和前人一样，可以通过下面的方式强调自己工作的作用：
However, data is still scarce
rare
less accurate
there is still dearth of
We need to
aim to
have to
provide more documents
data
records
studies
increase the dataset
Further studies are still necessary...
essential...
为了强调自己研究的重要性，一般还要在However之前介绍自己研究
问题的反方面，另一方面等等
比如：
1)时间问题
如果你研究的问题时间上比较新，你就可以大量提及对时间较老的问题
的研究及重要性，然后说(However)，对时间尺度比较新的问题研究不足
2)物性及研究手段问题
如果你要应用一种新手段或者研究方向，你可以提出当前比较流行的方法
以及物质性质，然后说对你所研究的方向和方法，研究甚少。
3)研究区域问题
首先总结相邻区域或者其它区域的研究，然后强调这一区域研究不足
4)不确定性
虽然前人对这一问题研究很多，但是目前有两种或者更多种的观点，
这种uncertanties, ambiguities，值得进一步澄清
5)提出自己的假设来验证
如果自己的研究完全是新的，没有前人的工作进行对比，在这种情况下，
你可以自信地说，根据提出的过程，存在这种可能的结果，本文就是要
证实这种结果。
We aim to test the feasibility (reliability) of the ...
It is hoped that the qutestion will be resolved (fall away) with our proposed
method (approach).
b) 提出自己的观点
We aim to
This paper reports on
provides results
extends the method..
focus on
The purpose of this paper is to
Furthermore, Moreover, In addition,, we will also discuss...
c) 圈定自己的研究范围
前言的另外一个作用就是告诉读者包括(reviewer)你的文章主要研究
内容。如果处理不好，reviewer会提出严厉的建议，比如你没有考虑
某种可能性，某种研究手段等等。
为了减少这种争论，在前言的结尾你就要明确提出本文研究的范围：
1)时间尺度问题
如果你的问题涉及比较长的时序，你可以明确地提出本文只关心这
一时间范围的问题。
We preliminarily focus on the older (younger)...
或者有两种时间尺度的问题 (long-term and short term)，你可以说
两者都重要，但是本文只涉及其中一种
2) 研究区域的问题
和时间问题一样，明确提出你只关心这一地区
d) 最后的原场
在前言的最后，还可以总结性地提出，这一研究对其它研究的帮助。
或者说，further studies on ... will be summarized in our next
study (or elsewhere)
总之，其目的就是让读者把思路集中到你要讨论的问题上来。减少
争论(arguments).
关于词汇以及常用结构，要经常总结，多读多模仿才能融会贯通。
怎样提出观点
在提出自己的观点时，采取什么样的策略很重要。
不合适的句子通常会遭到reviewer的置疑。
1)如果观点不是这篇文章最新提出的，通常要用
We confirm that...
2)对于自己很自信的观点,可用
We believe that...
3)在更通常的情况下，由数据推断出一定的结论，
用， Results indicate, infer, suggest, imply that...
4) 在及其特别的情况才可以用We put forward
(discover, observe..) .. "for the first time".
来强调自己的创新。
5) 如果自己对所提出的观点不完全肯定，可用
We tentatively put forward (interrprete this to..)
Or The results may be due to (caused by) attributed to
rsulted from..
Or This is probably a consequence of
It seems that .. can account for (interpret) this..
Or It is pisible that it stem from...
要注意这些结构要合理搭配。如果通篇是类型1)和5)，
那这篇文章的意义就大打折扣。如果全是2)，肯定会遭到
置疑。所以要仔细分析自己成果的创新性以及可信度。
连接词与逻辑
写英文论文最常见的一个毛病就是文章的逻辑不清楚。解决
的方法有：
1)句子上下要有连贯，不能让句子之间独立
常见的连接词语有, However, also, in addition,
consequently, afterwards, moreover, Furthermore,
further, although, unlike, in contrast, Similarly,
Unfortunately, alternatively, parallel results,
In order to, despite, For example, Compared with
other results, thus, therefore...
用好这些连接词，能够使观点表达得有层次，更加明确。
比如，如果叙述有时间顺序的事件或者文献，
最早的文献可用AA advocated it for the first time.
接下来，可用Then BB further demonstrated that..
再接下来，可用Afterwards, CC..
如果还有，可用More recent studies by DD..
如果叙述两种观点，要把它们截然分开
AA pput forward that...
In contrast, BB believe
or Unlike AA, BB suggest
or On the contrary (表明前面的观点错误，如果只是表明
两种对立的观点，用in contrast)， BB..
如果两种观点相近,可用
AA suggest
Similarily, alternatively, BB..
Or Also, BB
or BB allso does ..
表示因果或者前后关系，可用
Consequently, therefore, as a result,
表明递进关系，可用furthermore, further, moreover, in addition,
当写完一段英文，最好首先检查一下是否较好地应用
了这些连接词。
2) 段落的整体逻辑
经常我们要叙述一个问题的几个方面。这种情况下，一定要注意
逻辑结构。
首先第一段要明确告诉读者你要讨论几个部份
...Therefore, there are three aspects of this problen have to
be addressed.
The first questuon involves...
The second problem relates to
The thrid aspect deals with...
上面的例子可以清晰地把观点逐层叙述。
Or, 可以直接用First, Second, Third...Finally,..
当然,Furthermore, in addition等可以用来补充说明。
3) 讨论部份的整体结构
小标题是比较好的方法把要讨论的问题分为几个片段。
一般第一个片段指出文章最为重要的数据与结论。补充说明
的部份可以放在最后一个片段。
一定要明白文章的读者会分为多个档次。文章除了本专业
的专业人士读懂以外，一定要想办法能让更多的外专业人读懂。
所以可以把讨论部份分为两部份，一部份提出观点，另一部份
详细介绍过程以及论述的依据。这样专业外的人士可以了解
文章的主要观点，比较专业的讨论他可以把它当成黑箱子，而这一
部份本专业人士可以进一步研究。
为了使文章清楚，第一次提出概念时，最好加以个括弧，给出
较为详细的解释。
如果文章用了很多的Abbreviation, 两种方法加以解决
1) 在文章最好加上个Appendix，把所有Abreviation列表
2) 在不同的页面上，不时地给出Abbreciation的含义，用来
提醒读者。
总之，写文章的目的是要让读者读懂，读得清晰，并且采取各种
措施方便于读者。
定要注意绝对不能全面否定前人的成果，即使在你看来
前人的结论完全不对。这是前人工作最起码的尊重，英文
叫做给别人的工作credits.
所以文章不要出现非常negative的评价，比如Their results
are wrong, very questionable, have no commensence, etc.
遇到这类情况，可以婉转地提出：
Their studies may be more reasonable if they had
considered this situation.
Their results could be better convinced if they ...
Or Their conclusion may remain some uncertanties.
讨论部份还包括什么内容?
1. 主要数据特征的总结
2. 主要结论以及与前人观点的对比
3. 本文的不足
第三点，在一般作者看来不可取。事实上给出文章的不足恰恰
是保护自己文章的重要手段。如果刻意隐藏文章的漏洞，觉得
别人看不出来，是非常不明智的。
所谓不足，包括以下内容:
1. 研究的问题有点片面
讨论时一定要说，
It should be noted that this study has examined only..
We concentrate (focus) on only...
We have to point out that we do not..
Some limitations of this study are...
2. 结论有些不足
The results do not imply,
The results can not be used to determine
be taken as evidence of
Unfortunately, we can not determien this from this data
Our results are lack of ...
但是，在指出这些不足之后，随后一定要再一次加强本文的重要性
以及可能采取的手段来解决这些不足，为别人或者自己的下一步
研究打下浮笔。
Notwithstading its limitation, this tudy does suggest..
However, these problems could be solved if we consdier
Despite its preliminary character, this study can clearly indicate..
用中文来说，这一部份是左右逢源。把审稿人想到的问题提前
给一个交代，同时表明你已经在思考这些问题，但是由于文章
长度，试验进度或者试验手段的制约，暂时不能回答这些问题。
但是，这些通过你的一些建议，这些问题在将来的研究中游可能
[印象派 (2-8 16:28, Long long ago)]
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sForum ][登录后回复]2楼
科研生活及其习惯科研生活及其习惯
目录：
一、研究生生活和现状
二、做好计划
三、研究过程中的注意点
四、如何查阅文献
五、如何作实验
六、如何发表论文
七、如何写论文
八、如何保持健康
九、其它一些小伎俩
我的三年的研究生生活就快结束了，刚好好几个好朋友开始读研究生，我想就把自己这三年的一些体会写下来，供他们参考，让他们的研究生生活更为完美一些吧！取名《研究生如何做好毕业课题》，其实就是整个研究生生活各个方面的一些体会心得。希望能有些作用。身为研究生，课题的研究可以说是几年工作学习的重中之重，如何做好毕业课题是每个研究生必须关注的话题，所以主要就写这个方面。
一、研究生生活和现状
目前研究生一般第一年上课，名师门下的学生一般第一年一边上课一边开始着手课题的研究，我觉得这样比较好，因为有了课题明确的方向就可以有的放矢的学习。后面的两年自然是进行研究工作，主要完成毕业论文和发表一些journal论文。关于课程的学习我觉得好多老师的教材和水平已经大大落后于现状，所以重在自学，当然老师们的经验一般比较丰富，值得好好学习，主要学习什么呢？我觉得这个学习主要一个方面的内容就是为毕业课题服务的，所以就我们的专业来说，我觉得主要学一些实验的技术（包括常规技术和新技术，虽然新技术学校没有条件作，但是必然是很有用处），分析测定方法，数据处理和实验设计方法（学校老师的水平不佳，可以向有经验的师兄师姐学习），当然作为中国学生，英语是要好好学的，其实也很必要尤其是专业外语，在查阅文献时尤其重要。
目前我觉得我们研究生有几个极端，一些人就随导师的安排做事情，没有自己的想法和观点，反正时间一到毕业，我们的有些同学为导师作好多相当于家务事的事情，我觉得帮导师干活有时必要，但是不能占用自己的很多时间。另一种人是完全游离的状态，导师比较忙没有时间管，然后就自己想干什么干什么，我觉得这样更不好，都研究生了，自然要自律，适当的和导师保持联系，这样才能在学到东西的同时完成好自己的课题研究。
二、做好计划
我是个爱作计划的人，实际上虽然研究生生活有三年，但是过起来N快，所以我觉得做好计划是很必要的，必然有些人在这其中要打工，要出国，要考什么证书等，时间就更为宝贵，所以计划还是尤其重要的。在三年中，要作的事情很多，比如发表论文，要经过几次审稿，一般要1-2个月，到发表多的要6个月，所以要提前投稿，有些人等到答辩就太晚，这只是个例子，其它还有很多事情要好好安排。
作课题的主要步骤和内容：开始导师给课题自己选或者自己找课题（自己找比较麻烦，最好找好几个给导师或者有经验的人看），这其中要注意的问题就是自己的实验室有没有实验仪器的条件可以满足自己作相关的研究，测定分析分离等方法需要的材料容不容易得到，实验原料等等。选定课题以后就是对课题进行查新和研究，看看该课题的研究进展，对自己以后的研究要有一个初步的想法，这里提到一点就是对中文文献，尤其是非核心刊物，要持有怀疑的态度去看，只能是对常识性的了解，真正的研究要有足够的英文资料，同时也提高自己的英文能力。要是这一步作不好，后来发现在重新定课题都比较悲惨啦！（同学中有例子）如果你的研究结果肯定可以进行研究了，就要进行一些初步的实验，一来实际了解一下实验，二来从整体上对自己实验的难度有体会。然后就是按照制定的计划全面的开始研究，最后阶段就是写论文答辩。看起来很简单，但是其中有好多事情要作。
大致的安排如下：（各人情况不同）
第一学期：了解熟悉课题，学习课程
第二学期：查阅研究，确定课题，适当熟悉实验，学习课程
第三学期：开始研究，全面熟悉
第四学期：开始发表论文，主要实验阶段
第五学期：最后实验补充，发表研究论文
第六学期：写论文答辩
当然作实验的具体计划要非常仔细。
三、研究过程中的注意点：
◆处理数据定期汇总
我个人认为要养成好的习惯，每天需总结当天实验情况，并初步的进行分析，如果该实验要好几天才能完成则要立即进行分析，要是长期搞研究的最好有研究日志，这样不管实验进行多久也有据可查！而且写论文可以轻松好多！
◆设计和处理实验
要用短的时间作更多的实验或者做好实验就要采用好的实验设计方法，必将事半功倍！当然运用软件也很是重要。最基础的是office里面的word、excel和PowerPoint
其次管理文献要用到Scinote、Reference manager处理数据要用SPSS、SAS当然一般的处理还是用Excel比较方便，不过一些复杂的还是要学，画分子式，三维效果Chem.
Office、Chemistry Windows等等，计算MathCAD，建模Mathematic等等，其实有些功能是大的软件都有的。软件也不止这么几个，反正是要好好学！广阔的学！
◆适时的补充文献
世界每一天都在变化，要不断补充新的文献，其次实验可能，很可能和自己想象的差异很大，这时候就要再查阅一些文献来进行研究，有时候要对自己的计划作很大的修改！
◆交流的思想
现在网络越来越方便，一定要有交流的思想，现在那些教授大多数为了保密，或者领先于人等其它等等原因，搞得很难交流，课题讨论的气氛也没有。所以交流这一点我觉得很重要，目前的状况其实是限制研究生研究水平提高的一个重要方面，平时要注意和同学，师长，老师交流，当然BBS也是一个很好的途径，世间高手很多，向每一个有优点的人学习，其实每个人都有优点，所以交流也就是个学习的过程，很重要！
四、如何查阅文献
由于大部分院校未能购卖国内外商业医学数据库，如PUBMED、ElseVier等，因而检索国外全文文献很复杂。这往往成为少数学校的专利。这太可惜了，由于版权等多种原因，下面介绍一些可行的方法。
◆根据作者E-mail地址，向作者索要。
这是最有效的方法之一。为了更方便大家向作者索取原文，但一定要简洁！一般都愿意向你提供。如果作者有自己的主页，可以去作者的主页看看。不过一般查找作者的主页倒不容易！
记住你的信箱尽量大一点，否则一些大的文件搞不定！下面是联系信的模版：
1 Dear Mr./Mrs.: ________（Author name）
I am a graduate student of Harbin Medical University in China. I major in "________"（您的专业）.
Recently, I found one of your articles, titled "__________" （文章名）in
Medline. I found it may help me achieve my goals in this research field. This would
make a really positive contribution to my work. I would like to be able to read
the full text of this article. The abstract makes the article sound very interesting.
I know there is usually a fee required to obtain the full article from Medline;
however, as a student, my only income is a small scholarship which is about U S
$30.00 per month. I wonder if you would consider sending me the full text by Email.
Perhaps you would consider this as an act of friendship between our two countries.
Thank you for your kind consideration of this request.
Sincerely: ___________（您的名字）
My Email address is: ____________________ （你的email地址）
日期：月/日/年
◆利用搜索引擎：
英文采用著名的搜索引擎，如Lycos，HotBot，Yahoo，我的主页的首页和文献检索中均有，输入详细的关键词（一定要具有特征性，防止搜索出太多的东西），末尾加PDF可能效果更好些。要是觉得不方便就到www.5566.org进入后点搜索，里面收集了十多个引擎，足够你查的，不过一般百度和google比较好！Lycos也不错。关键词很重要，要掌握一些技巧，否则不是漏检就是眼前是个文件的海洋，捞不到针！
◆按部就班，根据文章出处，去图书馆查找原文。
当然去一些较大图书馆。 如上海图书馆就可以查到华东地区所有图书馆都有那些资料。自己的资料也比较全，尤其是一些热门的近期的，老的也很多，但是那里人比较多，有时候要查好久！要是图书馆有机检数据库还好，要是只有什么厚厚的CA你就比较悲惨啦！查吧！复印吧！不要钱但是要时间！
◆付费中文全文或者与国内一些图书馆联系
中文文献，大多需要买，万方数据库（万方系统中有1000余种电子期刊，以理工科技类为主，全部是国内出版的中文和英文期刊，比印刷版略晚。中文文献价值一般欠高！（个人意见）CNKI（CNKI：中国期刊网提供三种类型的数据库，题录数据库、题录摘要数据库和全文数据库，其中前两者属参考数据库类型，只提供目次和摘要，可在网上免费检索，全文数据库需付费。）重庆维普资讯公司（收录有中文报纸1000种,中文期刊12000种,外文期刊4000种,拥有固定客户2000余家。维普有两种注册用户，一种是可以查阅全文的，这种是要收费的。）超星图书馆（若要文章，可通过超星图书馆，从网易上下载超星图书馆专用下载器即可免费下载了！极好！您可免费下载十万种书，否则你也可以直接阅读。
有些学校购买过就不要钱。找到你需要的类别，再输入关键词，检索结果出来后，可以获知文章的出处。内容之全，范围之广，更新之快，比万方数据库强多了。但就是不能免费查全文和摘要。如果你愿意交费也可以。查到有关资料可以通过email向全国各地的图书馆购买，但是每个图书馆的价格不同，事前应该有一定的调查。
◆积累一些常常去的网站
很多！没事干的时候到全国各地的图书馆网站逛逛，肯定有很多收获！
◆利用一些软件Scinote，reference manager等等
这些软件的demo版本网络里面都可以有下载，一般自己会收录一些引擎，不妨自己试一试，而且作学术这些软件至少要有些了解啦！
◆到一些高校尤其是211重点高校的同学那里求得帮助。
现在网络很方便，只要在这些学校内部的网络上一般可以下载很多有用的全文，可以先到相关大学的图书馆看看都有什么数据库。朋友多也是件很好的事情，虽然世界人与人变得比较远，可是朋友却越来越重要啊！
◆到一些论坛寻求帮助
现在我国一些医学化学的论坛作得好好哦！尤其是中科院（生命技术）和一些比较大的牛的高校（北大、清华、南大、复旦等等啦！），去那里和牛人们交流寻求帮助，一定大有裨益！不信你试试看！
五、如何作实验
作实验前当然要先计划啦！很具体，我一般作实验前要仔细呆想半天，仔细到要多少Tubes，beakers都知道，每个步骤要多少时间，我尽量是不会影响吃饭的：）。最好写在实验记录上面。等一些仪器准备好了再动手，按部就班，一般成功的把握就大。记录数据要有一定的格式和规范，不要乱，要能够自己任何时间都可以看懂。处理数据要及时，并有初步结论。对同一种实验要最好参考两个参考书，并仔细阅读过程，想想一些关键的地方。实验中还有一个面对失败的问题。Those
who aim at great deeds must suffer greatly.实验常常累的要命还得不到好的结果，我的同学就有作实验很认真，作了很多次还没有得到预期的结果，而同样相似的实验，不是很认真的却能作出啦，要是我也会郁闷的要命的。但是没有办法，郁闷只会影响自己的实验进度，所以要持之以恒，不断努力。当然遇到困难的时候，也不要蛮干，要停下来想想自己是否在某一个环节上出了差错！
六、如何发表论文
发表论文是很重要的，我们学院要求每个人必须发表一篇以上的核心论文。要发表实现是写，自己想写到什么程度，等写好了看看自己论文的档次适合发表什么样子的刊物，（关于刊物知名度导师知道，关于刊物的联系网络上有，各个学校的图书馆网页上都应该有）要是发表的刊物太差，有些可惜，要是太好，命中率太低。所以要一个很好的定位，当然发表前要给导师看过，发表在中文刊物上要上网查（或者到图书馆查第一期）投稿指南或者约稿简则，看看对格式，对内容，对字数，有些甚至对参考文献的条数也有规定，在寄出前要检查好几次，尽量不要有错误，格式符合刊物的要求，尤其是对参考文献，要求比较多。发送的方式很多，最好我认为Email和邮件同步发送，这样确保论文能到编辑手中！发送同时最好有一个和这个文章相关的介绍和自己的介绍，就是说自己的文章重要，新，好！到了一个月左右要主动和杂志社联系，要是要求修改稿件要抓紧时间修改，在此送出之前要写好一份修改说明，对修改的每一个地方作详细说明。然后尽早寄出！
关于发表英文文献我没有经验，不过听师兄说要注意几点：论文有创新点，就是别人没有的东东；测定方法和实验手段，仪器要好先进，符合国际要求；实验处理方法要科学；英文的表达要符合科学论文的要求，要有一定的写作水平才行。
七、如何写论文
写论文之前要研究一下论文的格式，只是看看过去的论文还不行的，因为有些过时，一些学校近一些年开始，逐步对论文的格式有严格的要求，一般在网站上都有规定，一定要下载一份过来看看，然后按照自己的实验内容初步拟定一个纲要，包括每一章的主要内容，给老板看了通过了在进行具体的写作，要是平时分析积累的比较多，这时候相对就比较轻松。
一般包括封面，中英文摘要，目录，绪论（主要介绍课题，研究的背景、主要内容等等），第1-X章（一般我认为硕士论文4-6章就可以，每章有引言、材料和方法、结果和讨论、主要结论等），主要结论（尽量体现创新点，简介一些），参考文献，致谢（要发挥个人才艺，用简短的文字表达自己，很体现个性的地方），发表论文目录（要是多就很有成就感），附录（可以包括程序或者重要数据或者方法还有符号说明等等）
八、如何保持健康
这个问题尤其重要，健康固然指身体健康和心理健康，有些同学尤其是哪些被称为“老同志”的，干活尤其卖命，一般我们睡觉都要到晚上12：00，第二天8：00准时出现在实验室导师才不会有意见，但是有些人晚上要到3-4：00，还有厉害的睡在实验室，吃在实验室。科学崇尚吃苦耐劳的精神，不排除有时候实验需要熬夜和连续作战，但是人不是铁打的，所以身体健康才是第一重要，除了要坚持锻炼，还要保持营养。易说难做，我作起实验也就忘记了锻炼好遗憾！身体好才会有好的精神状态去工作啊！当然心理也很是重要，研究生很多人是单身，尤其是博士要是单身，大家平时工作节奏强，交流时间少，就会觉得有些寂寞和难过，所以紧张的工作之余要多参加社交活动，多娱乐！不要几年研究生读完，人性全无，变成机器！我不知到是不是普遍现象，反正我身边很多例子如此，郁闷的要命！一点点活跃的气氛都没有，不要老是拉着脸过日子！
此外平时实验要注意安全，尤其是我们接触化学试剂的人要是不注意可能会带来伤害！这些可以看实验室的一些说明，要是没有，图书馆一般关于实验讲解的书附录里面都有的！
九、其它一些小伎俩
◆洗仪器：
发现洗衣粉洗不是很好，一般玻璃仪器用洗涤剂很管用，一般泡半个小时，再洗非常好，还有比色皿这种东西不能用东西擦，可有时候很脏，用洗涤剂也很管用，泡半个小时再用擦镜纸轻轻抹一下，N好！平时要是常用就把它泡在里面，会一直保持干净！
◆称取药品：
称取少量药品，尤其是X mg的时候尤其难，常常是药勺太大，很难精确称取。建议方法用一个干净的耳勺来称取，效果N好！【黄玲创】此外称量时要保持没有风！（废话大家都知道）
◆计算机使用：
实验室要是公用的计算机一定要保密和备份自己的文档，防止丢失！同时要进行完善的目录分类.我建议采用固定的个人文档的命名系统，来提高我们的工作效率。【文件名】作者姓名文献标题时间例：FanCD食品生物技术在工业中的应用20020806，作者姓名：最好采用英文姓拼音+名拼音的书写，FanCD表示姓范，名崇东，文献标题：取名时尽量包括文献中出现的关键词，时间：采用固定格式年分月份日期xxxx-xx-xx，不足的用0补全，如20020806表示2002年8月6日,出于一些专业需要，我们要表明文献的重要程度，机密度，可信度等可以采用以下规则，在上面的文件名后面添加。代谢字母+数字如Z0.代谢字母：取类型的拼音首字母，数字：越小表示程度越高.通过这样的命名，我们可以方便的挑取某作者的文献（根据文献名排序）。【文件目录系统】文件目录在计算机信息中有相当重要的作用，其实属于信息分类学的内容，日常生活中我们没有必要象国家图书分类法那样去对信息进行专业的分类，也不可能做到，但是我们必须有自己的分类方法，这是提高工作效率，节省时间的重要环结。目录命名方法因人、工作需要而大不相同。【版本信息】版本信息是大多数人忽略的一个问题。一般而言，windows操作系统下，浏览文件是包括一下属性：文档名称（文件名），文档格式，修改时间（计算机系统时间），大小（占有存储空间），属性（只读，隐藏、存档等），作者（建立的计算机注册名），这里要讲的是office文档版本信息，有了以上几点，相信你在日常的工作中，一定能快速准确的得到你所要的一切！[印象派 (2-8 16:32, Long long ago)]
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生物试验技术[印象派 (2-8 16:34, Long long ago)] [ 传统版 | sForum ][登录后回复]4楼
hmm....this one is quite interesting~[鱼片粥 (2-8 16:35, Long long ago)] [ 传统版 | sForum ][登录后回复]5楼
(引用 印象派:生物试验技术)关于PCR技术PCR反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段 也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR
产物特异性鉴定及变异分析。
核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
PCR常见问题总结
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带。
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
PCR污染与对策
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
对照试验
1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。
(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。
(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。
[印象派 (2-8 16:35, Long long ago)]
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(引用 鱼片粥:hmm....this one is quite interesting~)我准备写hyp paper了。。正在analyze result...先打打底[印象派 (2-8 16:35, Long long ago)] [ 传统版 | sForum ][登录后回复]7楼
(引用 印象派:英文科研文章写作技巧a)如何指出当前研究的不足以及有目的地引导出自己的研究的重要性
通常在叙述了前人成果之后，用However来引导不足�...)论文修改的重要性刀不磨不快，文章不改不好。古往今来，凡有成就的作家，没有不重视文章修改的。两干多年前的苟子说：“人之于文学也，犹玉之于琢磨也”。曹雪芹写《红楼梦》，于悼红轩中，披阅十载，增删五次，“字字看来皆是血，十年辛苦不寻常”。丹麦物理学家玻尔写《光与生命》，反复修改9遍，一直到他认为每个字句都完全表达了自己的本意，才正式发表。美国海明威把《老人与海》的手稿反复读过近200遍才最后付印。作家巴金说：“写到死、改到死；用辛勤的修改来弥补自己作品的漏洞”。由此可见，修改是论文写作中一个非常重要的环节，从某种意义上可以说是具有决定性作用的环节。
一、认识过程的艰巨性决定了修改的必然性
毕业论文要求大学生运用所学过的知识，理论联系实际，来阐述改革开放和现代化建设中一些带规律性的认识。论文是反映作者对客观事物的认识，而客观事物是丰富多彩、曲折复杂的，认识它不容易，反映它更是困难。因为，这种困难一方面来源于客观事物本身的内部矛盾有一个逐渐暴露过程，它的发展是曲折复杂的；另一方面这种困难来源于人的认识要受到各种主客观条件的制约，在认识过程的各个阶段中稍有疏忽，就容易出现片面性和主观性。毛泽东在《反对党八股》中指出：“文章是客观事物的反映，而事物是曲折复杂的，必须反复研究，才能反映恰当；在这里粗心大意，就是不懂得做文章的起码知识。”人们对研究对象的认识有个由现象到本质、由片面到全面、由不够深刻到比较深刻的过程。而且人们对研究成果的反映也有个由不够准确、恰当，到比较准确、恰当的过程。写论文就是对研究成果的反映，在从不够准确、恰当到比较准确、恰当的转变过程中就必然有一个修改的环节。列夫·托尔斯泰说过：“黄金要经过淘洗才能得到，精辟的、被表达得很好的思想也是这样。”由此可见，修改文章符合人的认识规律。
写论文，从本质说是一个认识过程，它包括由客观事物到人的主观认识的“意化”，过程和从主观认识到书面表现的“物化”过程。在意化过程中常常出现“意不符物”，即主观认识未能完全、正确地认识客观事物；而在物化过程中又容易发生“言不达意”即写成的文章不能完整、准确地反映作者的观点。因此，在写论文过程中，多一次修改就多一次认识；多一次修改就前进一步，至少可以减少失误和克服不足。正如作家老舍所说：“文章必须修改，谁也不能一下子就写成一大篇，又快又好。”
二、修改是论文写作中贯穿始终的重要环节
修改从形式上看是写作的最后一道工序，是文章的完善阶段，但是从总体来看，修改是贯穿整个写作过程的。写作一般可分为四个阶段，在每一个阶段都应该加强修改功夫。第一阶段，酝酿构思中的修改。论文在动笔之前，要酝酿构思打腹稿。修改就要从这里开始。如确立中心、选择题材、布局谋篇等等，都要经过反复思索，有分析也有综合。这不落笔端的修改，却决定着通篇的成败，腹稿改得好，写起来少走弯路。如果确定了一个严密的提纲，搭起一个好架子，文章结构就不会有大变动。所以动笔前一定要深思熟虑，不要信笔写来再作大改。第二阶段，动笔后的修改。落笔以后就进入细致的思索过程，形象思维与逻辑思维交用，有事理的推断，形象的探索，层次的划分，段落的衔接，句式的选检，词汇的斟酌、推敲。各方面都可能经过反复分析、对比、抉择，在改换取舍一些词语、句式、层次、段落之后完成初稿。这就是边写边改，边改边写的阶段。第三阶段，初稿后的修改。全文革成之后，要逐字逐句，逐层逐段的审读，作通盘的修改。在修改中不仅要酌字斟句，还要考虑材料取舍、层次安排、结构组织、中心的表达，等等。第四阶段，在指导老师指导下修改。指导老师审阅后，对草稿的优点给予肯定，并指出全文的不足。作者在听取指导老师的评讲后，要进一步发现自己文中的优缺点，研究要透，领悟要深，然后重新考虑修改。这时候的修改并不是一二次能结束的，修改的难度也比原先增大了。但是，如果改好了，文章水平可以有显著提高。
在这四个阶段中，初稿之后的修改更为重要。因为论文在起草初稿的过程中，作者对每个论点、论据不可能想得很周密，表达则更难做到准确无误。而在草稿写出后，作者的着眼点可以从局部写作转到总体审视，居高临下地检查，推敲中心论点的表达是否突出，各层次、段落的安排是否妥当。另外，作者的立足点可以从撰写者移到读者方面，比较超脱地对论文各个部分进行“评头论足”，“挑三拣四”，更客观和更严格地认真思考，反复推敲，使论文进一步趋于成熟和完美。
三、修改是提高写作能力的重要途径
毕业论文的写作是一种写作能力的锻炼和综合能力的训练。要提高写作能力，既要多写，更要多改。古人说：“善作不如善改”，“文章是改出来的”。有不少大学生思路敏捷，写东西也比较快，但是由于不重视文章的修改，推敲和琢磨较少，写成的文章往往结构比较松散，词句重复罗唆，错别字也较多，因而写作水平提高不快。应该把修改看作是写作过程的一个重要阶段。学习怎样修改文章，也是写作的一种基本训练，而且是更有效的训练。鲁迅把领悟“不应该那么写”——即修改初稿的方法，称为是“极为有益的学习方法”。从某种意义上说，会不会写文章，可以用会不会修改来衡量。只有到了会写也会改的时候，才可以说具有一定的写作水平和能力。正如契河夫所说：“写得好的本领，就是删掉写得不好的地方的本领”。通过修改论文，可以进一步提高遣词造句，结构文章的能力和逻辑推理的功夫。
修改论文，也是培养严谨的治学态度和良好学风的需要。写文章是给别人看的，会对社会产生一定的影响。因此，作者必须抱着对读者对社会的高度负责精神认真修改论文。认真修改论文，严格把关，这是一种严谨的科学态度和治学态度。鲁迅说过：“写完后至少看两遍，竭力将可有可无的字、句、段删去，毫不可惜。”他劝别人修改文章，他自己的文章也常常是反复修改的。他的著名散文《藤野先生》，修改的地方有160—170处，《＜坟》的题记》全文只有1000多字，改动也有百处之多。无产阶级的革命导师在修改他们的著作时，更是精益求精。马克思在《资本论》第一卷写完后，从头到尾作了修改。后来的德文第二版和法文译本，他又分别作了修改。他写《资本论》长达40年，中间经过多次修改，现在的前二卷的前一部分原稿，光保存下来的就有8种之多。保尔·拉法格在《忆马克思》一书中说：马克思“绝不出版一本没有经过他仔细加工和认真琢磨的作品。他不能忍受他未完成的东西公之大众的这种思想。要把他没有做最后校正的手稿给别人看，对他是最痛苦的事情。……有一天他对我说，他宁可把自己的手稿烧掉，也不愿半生不熟地遗留于身后。”这种对社会的高度负责精神，值得我们学习。我们可以从马克思这种高度负责的精神汲取无穷的力量。[印象派 (2-8 16:36, Long long ago)]
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(引用 印象派:英文科研文章写作技巧a)如何指出当前研究的不足以及有目的地引导出自己的研究的重要性
通常在叙述了前人成果之后，用However来引导不足�...)论文修改的范围论文修改有广义和狭义两种理解。广义的理解包括写作过程中每一个环节的修改；狭义的理解，则专指草稿完成之后的加工修改。不管是狭义的理解还是广义的理解，论文修改的内容和范围一般都包括：思想观点包括主题在内的修改、材料使用的修改、结构的修改、语言的修改等，下面分别谈谈各项修改的范围及其要求。
一、思想观点的修改。
写文章的主要目的是为了表达自己的思想，宣传自己的主张，如果自己的认识不深刻，甚至有错误，就不可能使别人得到教益。甚至会给人以坏的影响。文章的论点是文章的统帅，如果认识肤浅，见识不高，要想把文章的材料、结构等整理好，也是困难的。所以，修改论文，首先要考虑论文的主题和观点是否正确，认识是否深刻，文章有否新意。
第一，要综观全局，立足全篇，审视文章的中心论点是否正确、集中、鲜明、深刻，是否具有创新性，文题是否相符，若干从属论点与中心论点是否一致，某些提法是否全面、准确。如果中心论点把握不准确，不能把最典型、最具本质意义的思想和规律揭示出来，或者有某种失误和偏颇，就要动“大手术”，进行一次大改写甚至重写；如果文章中的论点落后于形势的发展，缺乏新意，就要重新构思和概括，或改变论证角度，进一步挖掘和提高。
第二，对于论文中出现的主观、片面、空泛的地方，要进行强化、增补等改写工作，使偏颇的改中肯，片面的改全面，模糊的改鲜明，粗浅的改深刻，松散的改集中，有失分寸的改恰当，陈旧的改新颖，立意太低的加以升华。
第三，修改论文的标题。论文的题目是论文的“眼睛”，如果题目短小精炼鲜明，就能传神生辉，使人一看就有兴趣。所以对初稿的题目进行斟酌、推敲和改动，是非常重要的。论文写作，文和题是互相作用、互相影响的。文要切题，题要配文，如果文不对题，题目过长或太笼统，都必须修改，使题目能概括地表达论文的中心论点和讨论的范围，起到“画龙点睛”的作用。
二、修改材料，主要指对论文引用的材料增加、删节或调整
材料是文章中的“血肉”，它是证明观点的论据，是论点成立的依托。因而对选用材料的基本要求是：一是必要，即选用说明观点的材料；二是真实，即所用的材料必须符合实际，准确可靠；三是合适，即材料引用要恰当，不多不少，恰到好处。在修改论文中，要看引用的材料是否确凿有力；是否有出处；是否能相互配合说明论点；是否发挥了论证的力量；是否合乎逻辑；是否具有说服力。要把不足的材料补足，要把空泛的陈旧的平淡的材料加以调换；要把不实的材料和与主题无关的材料坚决删除。
修改材料一般分两步进行：
第一步是查核校正，即先不考虑观点、结构、语言，只查核材料本身是否真实、可信、准确，包括对初稿中的定律、论断、数据、典型材料、引文出处等进行核对，发现疑点和前后矛盾的地方，一定要搞清楚、弄明白，如果弓1用了经典作家的话，如有条件最好核对原文，把一切失误、失实和有出入的材料给予删除或改写准确，保证论文建立在坚实可靠的基础之上。
第二步，根据论证中心论点和各分论点的要求，对材料进行增、删、调。对于缺少材料或材料单薄、不足以说明论点的，就要增补有代表性、有典型性的新材料，使论据更加充实，使论证变得更充分有力。对材料杂乱、重复，或材料与观点不一致的，则要删减，以突出观点，不能以材料多而取胜，应以适度为佳。对于陈旧、乎谈、一般化的材料，则要进行调换，换上更合适的材料。
三、修改结构
结构是论文表现形式的重要因素，是论文内容的组织安排。结构的好坏，直接关系着论文内容的表达效果。结构的调整和校正，关系着全文的布局和安排。调整结构，要求理顺思想，检查论文中心是否突出，层次是否清楚，段落划分是否合适，开头、结尾、过渡照应如何，全文是否构成一个完整的严密的整体。调整的原则和要求，是要有利于突出中心论点，服务于表现中心论点。
修改结构，应主要抓好以下三个方面：
第一，层次是否清楚，思路是否通畅。一般可以先从大小标题之间的关系来看文章的思路和层次。如果论文不设小标题，则必须从内容去判断。例如，文章在内容上是否符合“提出问题，分析问题，解决问题”的逻辑联系；全文的布局、层次和段落的安排是否有条理；层次的脉络是否分明、顺畅；各段的分论点是否明确、协调；对杂乱无章的阐述要疏理通顺；删去重复和矛盾的地方，补上缺少的部分，达到全文意思上连贯通畅。
第二，结构是否完整。论文要有一个完整的结构。一篇论文要有绪论、本论、结论三大部分协调一致，即要有引人入胜的开头，有材料有分析的论证，有鲜明、正确的观点和深刻有力的结尾。同时还要审视各个部分的主次、详略是否得当。
第三，结构是否严密。一篇论文必须是论点与论据，大论点与小论点之间有严密的逻辑性。如果论文结构松散，要加以紧缩，删去那些多余的材料，删去添枝加叶、离题太远或无关紧要的句段。为使结构严谨和谐，对全文各部分的过渡和照应、结构的衔接、语气的连贯等方面，也要认真地考虑和修改。
四、修改语言和标点
语言是表达思想的工具，要使论文写得准确、简洁、生动，就不能不在语言运用上反复推敲修改。论文的语言修改，主要是在三方面下功夫：一是表达清楚而简练，用最少的文字说明尽可能多的问题，是一篇高质量论文必不可少的条件。为了使文章精练，必须把罗唆、重复的地方，改为精练、简洁的文字；二是文字表达的准确性。为了语言的准确性，就要把似是而非的话，改为准确的文字；三是语言的可读性，为了语言的可读性，要把平淡的改为鲜明，把拗口的改为流畅，把刻板的改为生动，把隐晦的改为明快，把含混、笼统的改为清晰、具体。
如何加强语言的推敲和锤炼?
为了使语言准确、简洁、生动，不能不锤炼字句，而锤炼字句，必须要有正确的指导思想。对语言的锤炼加工，目的是为了更好地表情达意，所以锤炼不能脱离内容的需要，去孤立地雕琢文词，追求华丽。这是在指导思想上必须明确的。另外，在修改中要注意以下三个方面：
第一，要尽可能利用准确生动、简洁的语言，对生造词语、词类误用、词义混乱等用词不当、词不达意的毛病，要坚决改掉，坚决消灭错别字和不规范的简化字、自造词。鲁迅说他自己写文章“不生造除自己之外，谁也不懂的形容词之类”，“只有自己懂得或连自己也不懂的生造出来的字句，是不大用的”。这样一种严肃认真一丝不苟的精神，是值得我们认真学习的。
第二，对结构残缺、结构混乱、搭配不当等不合语法的句子，要注意改正，使之合乎语言规范。杜甫说：“为人性僻耽佳句，语不惊人死不休”。唐代作家皮日休说：“百炼成字，千炼成句”。字句要好，就必须反复锤炼、反复琢磨修改。
第三，要注意句子之间的逻辑联系，力求上下贯通，语气一致，通顺流畅。
第四，检查标点、规范书写。标点符号是文章的构成要素之一，是文章的有机组成部分，用得恰当，能够准确地表达内容；反之，就会影响内容的表达，甚至产生歧义。检查标点符号，主要是看标点符号的用法是否正确，以及调整点错位置的标点符号。修改时，要按约定俗成的用法，严格按规定的格式进行书写。另外，修改时，一定要把潦草的字和不规范的字改正，抄写时要书写工整、字迹清楚。还有，在修改中，对论文中的图表、符号、公式要检查，要合乎规范，对比较复杂的容易出错的，更应仔细校正。
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(引用 印象派:英文科研文章写作技巧a)如何指出当前研究的不足以及有目的地引导出自己的研究的重要性
通常在叙述了前人成果之后，用However来引导不足�...)科技论文英文摘要的撰写摘要的定义为：“以提供文献内容梗概为目的, 不加评论和补充解释, 简明、确切地记叙文献重要内容的短文”。由于大多数检索系统只收录论文的摘要部分，或其数据库中只有摘要部分免费提供, 并且有些读者只阅读摘要而不读全文或常根据摘要来判断是否需要阅读全文, 因此摘要的清楚表达十分重要。好的英文摘要对于增加论文的被检索和引用机会、吸引读者、扩大影响起着不可忽视的作用。
1 摘要的类型与基本内容
1.1 摘要的类型
根据内容的不同, 摘要可分为以下三大类：报道性摘要、指示性摘要和报道-指示性摘要。
（1）报道性摘要(informative abstract)：也称信息型摘要或资料性摘要。其特点是全面、简要地概括论文的目的、方法、主要数据和结论。通常, 这种摘要可部分地取代阅读全文。
（2）指示性摘要 (indicative abstract)：也称为说明性摘要、描述性摘要（descriptive abstract）或论点摘要（topic abstract）。一般只用二、三句话概括论文的主题, 而不涉及论据和结论, 多用于综述、会议报告等。此类摘要可用于帮助读者决定是否需要阅读全文。
（3）报道-指示性摘要(informative-indicative abstract)：以报道性摘要的形式表述一次文献中信息价值较高的部分, 以指示性摘要的形式表述其余部分。
传统的摘要多为一段式, 在内容上大致包括引言(Introduction)、材料与方法(Materials and Methods)、结果(Results)和讨论(Discussion)等主要方面, 即IMRAD（Introduction, Methods, Results and Discussion）结构的写作模式。
1980年代出现了另一种摘要文体, 即“结构式摘要”(structured abstract), 它是报道性摘要的结构化表达，强调论文摘要应含有较多的信息量。结构式摘要与传统摘要的差别在于，前者便于读者了解论文的内容, 行文中用醒目的字体（黑体、全部大写或斜体等）直接标出目的、方法、结果和结论等标题。
1.2摘要的基本结构和内容
摘要本质上是一篇高度浓缩的论文, 所以其构成与论文主体的IMRAD结构是对应的。摘要应包括以下内容梗概：（1）目的：研究工作的前提、目的和任务, 所涉及的主题范围；（2）方法：所用的理论、条件、材料、手段、装备、程序等；（3）结果：观察、实验的结果、 数据、性能等；（4）结果的分析、比较、评价、应用, 提出的问题, 今后的课题, 假设、启发、建议、预测等；（5）其它：不属于研究、研制、调查的主要目的, 但具有重要的信息价值。
一般地说, 报道性摘要中（2）、（3）、（4）应相对详细, （1）和（5）则相对简略。指示性摘要则相反。
结构式摘要与传统一段式摘要的区别在于，其分项具体, 可使读者更方便、快速地了解论文的各项内容。统计表明, MEDLINE检索系统所收录的生物医学期刊目前已有60%以上采用了结构式摘要。我国有些医学类期刊在20世纪90年代初开始采用结构式摘要, 并对其使用效果和进一步优化进行了较为深入的探讨。
结构式摘要的构架及简要说明 (1)目的(Objective)：研究的问题、目的或设想等；( 2)设计(Design)：研究的基本设计, 样本的选择、分组、诊断标准和随访情况等； (3)单位(Setting)：说明开展研究的单位（是研究机构、大专院校, 还是医疗机构）； (4)对象(Patients, Participants)：研究对象（患者等）的数目、选择过程和条件等； (5)处置(Interventions)：处置方法的基本特征, 使用何种方法以及持续的时间等；( 6)主要结果测定(Main Outcome Measures)：主要结果是如何测定、完成的； (7)结果(Results)：研究的主要发现（应给出确切的置信度和统计学显著性检验值）； (8)结论(Conclusions)：主要结论及其潜在的临床应用。
实际上, 8个层次比较适合于临床医学类原始论文(Original Article)。对于综述类论文,其结构式摘要应包括以下6个方面：(1) 目的(Objective), (2) 资料来源(Data Sources), (3) 资料选择(Study Selection), (4) 数据提炼(Data Extraction), (5) 资料综合(Data Synthesis), (6) 结论(Conclusions)。
为节省篇幅, 有些期刊在使用中对上述结构式摘要进行了适当简化, 如“New England Journal of Medicine”采用背景(Background)、方法(Methods)、结果(Results)、结论(Conclusions)等4个方面；“The Lancet”则采用背景(Background)、方法(Methods)、发现(Findings)和解释(Interpretation) 等4个方面。
JAMA (The Journal of the American Medical Association)是采用结构式摘要全部项目的为数不多的期刊之一, 其原始性论文的摘要须包括9项(Context, Objective, Design, Setting, Patients, Interventions, Main Outcome Measures, Results, Conclusion), 但作者可根据需要将相关项目合并。
与传统摘要比较, 结构式摘要的长处是易于写作（作者可按层次填入内容）和方便阅读（逻辑自然、内容突出），表达也更为准确、具体、完整。
应该说, 无论是传统的一段式摘要, 还是结构式摘要, 实际上都是按逻辑次序发展而来, 没有脱离IMRAD的范畴.
2 摘要撰写技巧
2.1 摘要撰写的一般技巧
为确保摘要的“独立性”(stand on its own)或“自明性”(self-contained), 撰写中应遵循以下规则：（1）为确保简洁而充分地表述论文的IMRD, 可适当强调研究中的创新、重要之处(但不要使用评价性语言)；尽量包括论文中的主要论点和重要细节（重要的论证或数据）。（2）使用简短的句子, 表达要准确、简洁、清楚；注意表述的逻辑性, 尽量使用指示性词语表达论文的不同部分（层次）。 如使用“We found that…”表示结果，使用“We suggest that…”表示讨论结果的含义等。（3）应尽量避免引用文献、图表, 用词应为读者所熟悉。若无法回避使用引文, 应在引文出现的位置将引文的书目信息标注在方括号内；如确有需要（如避免多次重复较长的术语）使用非同行熟知的缩写, 应在缩写符号第一次出现时给出其全称。（4）为方便检索系统转录, 应尽量避免使用化学结构式、数学表达式、角标和希腊文等特殊符号。（5）查询拟投稿期刊的读者须知, 以了解其对摘要的字数和形式的要求。如果是结构式摘要, 应了解其分为几段，使用何种标识，使用何种时态，是否使用缩写或简写，等。
2.2 摘要写作的时态
摘要所采用的时态应因情况而定,力求表达自然、妥当。写作中可大致遵循以下原则。
2.2.1 介绍背景资料
如果句子的内容是不受时间影响的普遍事实, 应使用现在式；如果句子的内容是对某种研究趋势的概述, 则使用现在完成式。 如：
The authors review risk and protective factors for drug abuse, assess a number of approaches for drug abuse prevention potential with high-risk groups, and make recommendations for research and practice.
Previous research has confirmed four dimensions of temperament: ….
2.2.2 叙述研究目的或主要研究活动
如采用“论文导向”, 多使用现在式（如：This paper presents…）; 如采用“研究导向”, 则使用过去式（如：This study investigated…）.
This article summarizes research on self-initiated and professionally facilitated change of addictive behaviors using the key transtheoretical constructs of stages and processes of change.
We investigated whether captopril could reduce morbidity and mortality in patients with left ventricular dysfunction after a myocardial infarction.
2.2.3 概述实验程序、方法和主要结果 通常用现在式。
We describe a new molecular approach to analyzing the genetic diversity of complex microbial populations.
Our results indicate that p21 may be a universal inhibitor of cyclin kinases.
2.2.4 叙述结论或建议
可使用现在式、臆测动词或may, should, could等助动词。
We suggest that climate instability in the early part of the last interglacial may have delayed the melting of the Saalean ice sheets in America and Eurasia, perhaps accounting for this discrepancy.
2.2 摘要写作的人称和语态
有相当数量的作者和审稿人认为, 科技论文的撰写应使用第三人称、过去时和被动语态。但调查表明, 科技论文中被动语态的使用在1920 - 1970年曾比较流行, 但由于主动语态的表达更为准确, 且更易阅读, 因而目前大多数期刊都提倡使用主动态。国际知名科技期刊“Nature”, “Cell”等尤其如此, 其中第一人称和主动语态的使用十分普遍。
为了解专业期刊对写作风格的规定, 有人随机抽查了500份医学和生物学英文期刊的“读者须知”。统计表明, 82%的期刊没有文风方面的规定。
可见, 为简洁、清楚地表达研究成果, 在论文摘要的撰写中不应刻意回避第一人称和主动语态。
3 摘要的常用表达方法
由于摘要的英文表达要求用词简明、层次清楚, 因此掌握一些特定的规范表达, 甚至建立一个适合自己需要的“句型库”(stock phrases), 对于摘要的撰写是很有帮助的。本文所选取的例句均源于SCI收录的1992 - 2002年间发表、并具较高被引频次的论文（前100位）摘要（选取例句时偏重于第一人称和主动语态）。
3.1 引言部分
3.1.1 回顾研究背景 常用词汇有：review, summarize, present, outline, describe等。 如：We review evidence for this view of addiction and discuss its implications for understanding the psychology and neurobiology of addiction.
This paper outlines some of the basic methods and strategies and discusses some related theoretical and practical issues.
3.1.2 阐明写作或研究目 常用词汇有：purpose, attempt, aim等。另外还可以用动词不定式充当目的状语来表达。如：
We attempt to recover a function of unknown smoothness from noisy sampled data.
To investigate the mechanism of Bcl-2's effect, we examined whether Bcl-2 interacted with other proteins.
3.1.3 介绍论文的重点内容或研究范围 常用的词汇有：study, present, include, focus, emphasize, emphasis, attention等。
Here we study the dependence of apoptosis on p53 expression in cells from the thymus cortex.
This article includes a brief review of the physics underlying HERWIG, followed by a description of the program itself.
3.2 方法部分
3.2.1 介绍研究或试验过程 常用词汇有：test, study, investigate, examine, experiment, discuss, consider, analyze, analysis等。
We use N-body simulations to investigate the structure of dark halos in the standard cold dark matter cosmogony.
We present an analysis of atmospheric neutrino data from a 33. 0 kton yr (535-day) exposure of the Super-Kamiokande detector.
3.2.2 说明研究或试验方法 常用词汇有：measure, estimate, calculate等。
We have developed a global model to estimate emissions of volatile organic compounds from natural sources (NVOC).
This study presents estimates of lifetime and 12-month prevalence of 14 DSM-III-R psychiatric disorders from the National Comorbidity Survey, …
3.2.3 介绍应用、用途 常用词汇有：use, apply, application等。
Our program uses a maximum likelihood approach and is based on version 3. 3 of Felsenstein's dnaml program.
As an application, we implement a compact image coding algorithm that selects important edges and compresses the image data by factors over 30.
3.3 结果部分
3.3.1 展示研究结果 常用词汇有：show, result, present等。
We show this cell death to be dependent upon expression of c-myc protein and to occur by apoptosis.
Our results suggest a widespread role for the nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate system in the nervous system.
3.3.2 介绍结论 常用词汇有：summary, introduce, conclude等。
We introduce a procedure, SureShrink, that suppresses noise by thresholding the empirical wavelet coefficients.
By means of informal mathematical arguments, simulations and a series of worked examples, we conclude that PQL is of practical value for approximate inference on parameters and realizations of random effects in the hierarchical model.
3.4 讨论部分
3.4.1 陈述论文的论点和作者的观点 常用词汇有：suggest, report, present, explain, expect, describe等。
The results suggest that abnormalities in male sex development induced by p, p'-DDE and related environmental chemicals may be mediated at the level of the androgen receptor.
In this study, we describe a psychobiological model of the structure and development of personality that accounts for dimensions of both temperament and character.
3.4.2 阐明论证 常用词汇有：support, provide, indicate, identify, find, demonstrate, confirm, clarify等。
We showed that it is possible to identify constituents which represent only 1% of the total population.
These results demonstrate that p53 is required for radiation-induced cell death in the thymus but is not necessary for all forms of apoptosis.
3.4.3 推荐和建议 常用词汇有：suggest, suggestion, recommend, recommendation, propose, necessity, necessary, expect等。
The authors suggest that the most promising route to effective strategies for the prevention of adolescent alcohol and other drug problems is through a risk-focused approach.
We propose two algorithms to estimate the significance level for a test of HWP.
4 结论
论文摘要的撰写应充分考虑论文的主要内容, 故应使用简洁的文字将论文的精华高度地概括出来。摘要的内容应大致包括IMRAD结构的论文写作模式.
写作时要尽量使用第一人称和主动语态, 对时态的选择应根据表达的需要灵活运用。
此外, 还应根据论文的内容和表达的需要选择合适的摘要类型（报道性摘要、指示性摘要、报道-指示性摘要）, 是否采用结构式摘要需视相应期刊的要求而定。
5 参考文献
http://essentialscience.com/（任胜利, 国家自然科学基金委员会科学基金杂志社，rensl@mail.nsfc.gov.cn
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(引用 印象派:生物试验技术)关于PCR技术 backgroundPCR技术概论
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域 中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史
PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
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(引用 印象派:生物试验技术)PCR常见问题总汇PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物
1)克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素 ： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
[印象派 (2-8 16:41, Long long ago)]
[ 传统版 |
sForum ][登录后回复]12楼
(引用 印象派:生物试验技术)细胞培养基本技术概述无菌操作基本技术
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %
ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每
次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间
污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间
隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦
拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操
作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打
开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，
尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒
感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程
中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐
针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：
5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300
小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验用品
1. 种类︰
1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌
制品。
1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,
plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透
明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml
2. 清洗︰
2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。
2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干
净，勿加清洁剂清洗。
3. 灭菌︰
3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于
oven 中烘干。
3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170 oC, 4 小时。
3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高
压灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟处理。
培养基
1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。
2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，
可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培养基配制(以1 升为例)：
3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为
7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成
pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，
然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生
长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。
3.2. 材料：
3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)
3.2.2. 粉末培养基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 电磁搅拌器
3.2.5. 无菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空帮浦
3.2.9. CO2 气体
3.3. 步骤：
3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。
3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml
milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后
溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。
若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，
pH 会升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养
基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)
3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。
4. 配制培养基之生长测试
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步骤：
4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35
mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。
4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群
落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。
4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy's 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静
置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不
佳，则丢弃之。
抗生素
1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素
1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。
1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待
token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml +
streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制
mycoplasma 生长。
4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin
250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。
5. 抗生素使用种类与浓度：
工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
血清
1. 血清必须贮存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，请勿超过一个月。如果一次无法用完一
瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，
必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加
入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室
温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇
晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20 oC 直接
至37 oC 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均
匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建
议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：
cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and
platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell
type。
5. 勿将血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较
不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性
及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本
身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上
清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会
阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。
有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清
放在37 oC 中欲培养此“微生物“，但在37 oC 环境下，又会使此沈淀物增多，更
会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此
小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批
号的血清。
7. 血清之生长测试
7.1. 材料：
7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)
7.1.4. methanol
7.1.5. glacial acetic acid
7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
7.2. 步骤：
7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80
% confluency。
7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细
胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102 活
细胞数/ ml。
7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血
清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10
% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。
7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大
到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。
7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy's 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静
置10 min。
7.2.6. 去除固定液，水洗二次。
7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
7.2.8. 去除染液，水洗二次。
7.2.9. 以肉眼计数群落数
7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )：
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)：
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。
7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于–70 oC 保存之
冷冻细胞活化
1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死
亡。
2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生
单株抗体或是其它蛋白质)。
3. 材料
3.1 37 oC 恒温水槽
3.2 新鲜培养基
3.3 无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶
3.4 液氮或干冰容器
4. 步骤：
4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时
盖子易松掉。
4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无
菌操作台内。
4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全
部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为
1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作
存活测试。
4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异，
一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞
悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清
液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。
4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞
种类而异。
2. 材料：
2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco's phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,
GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：
以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽
回温。
2.3. 新鲜培养基
2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
3. 步骤：
3.1. 附着型胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉旧培养液。
3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用数分钟，于倒
立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶
液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清
之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。)
3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数
次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常
培养条件培养。
3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的
培养瓶中，以正常培养条件培养。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可
能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基
稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。
细胞计数与存活测试
1. 原理：
1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。
1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形，
其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方
盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计
数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞
数目。
1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细
胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细
胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
2. 材料：
2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.2. Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl
paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)
2.4. 计数器(counter)
2.5. 低倍倒立显微镜
2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步骤：
3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于
1.5ml 小离心管中。
3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于
100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin
bluish)。
3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue
等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线
上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml
*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细
胞。
3.5. 范例：
T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan
blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之
细胞数目。
活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59
死细胞数/方格：5, 3, 4, 6
细胞总数= 243
平均细胞数/方格= 60.75
稀释倍数= 2
细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
细胞冷冻保存
1. 注意事项：
1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％
致密度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二
日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron
FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积
分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽
灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻
浓度太高而在解冻24 小时后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须
较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106
cells/ml。
1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保
存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
1.6. 冷冻方法：
1.6.1. 传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)
---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1 ～ -3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，
放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
2. 材料：
2.1. 生长良好之培养细胞
2.2. 新鲜培养基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球计数盘与盖玻片
2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)
3. 步骤：
3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10
％，混合均匀，置于室温下待用。
3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细
胞浓度及冻前存活率。
3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混
合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污
染检测。
3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小
时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序
为: program 7: HB CELL
收到细胞的处理方式
细胞活化︰
1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞
株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。
2. 冷冻细胞解冻程序:
2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比
例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之
血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养
基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse
serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种
类培养之。
2.3. 将培养基置于37 °C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无
菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可
接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全
部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。
2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask
中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混
合均匀，放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。
2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活
化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除， 待第二天确定细胞生长或贴附良
好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需
立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，
离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，
将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。
收到T25 flask 细胞时， 处理方式为︰
1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查
flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题， 不
要打开盖子，请立即通知细胞实验室。
2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 °C， 并
让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask
内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依
一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。
[印象派 (2-8 16:41, Long long ago)]
[ 传统版 |
sForum ][登录后回复]13楼
(引用 印象派:生物试验技术)细胞培养FAQ1、冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。
10、悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。
12、细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13、细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
15、冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微
降低一些。
16、细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
17、应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
18、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。
19、支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，
无法以其外观分辨之。
20、支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
21、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
22、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
23、为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。
24、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
25、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
26、购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。
27、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧
[印象派 (2-8 16:45, Long long ago)]
[ 传统版 |
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(引用 印象派:科研生活及其习惯科研生活及其习惯
目录：
一、研究生生活和现状
二、做好计划
三、研究过程中的注意点
四、如何查阅文献
五、如何作实�...)作科研的体会作科研的体会
01 一半时间做实验，一半时间看文献。
千万不能把时间全部消耗在实验台上。看文献、看书、看别人的操作、听别人的经验、研究别人的思路，边做边思考。要学会比较，不要盲从。否则，会被一些小小的问题困扰许久。
02 准备越充分，实验越顺利。
古人云，磨刀不误砍柴工。前期的知识储备、文献储备、材料准备、方法准备可以避免手忙脚乱，充分的预实验使你充满信心。一步一个脚印，就不必“从头再来”。最不能容忍的是在开始的几步偷懒，造成后面总有一些无法排除的障碍。
03 记录真实详尽。
人总是有一点虚荣心的。只把成功的步骤或漂亮的结果记到实验记录里，是很多人的做法。殊不知，许多宝贵经验和意外发现就这样与你擦肩而过。客观、真实、详尽的记录贵的财富。
04 不要为老板省钱。
效率为先。整天算计着省钱，一旦用了不可靠的东西，只会浪费时间，遭受打击，到头来一分钱也省不了。
05 把握心理优势。
做过实验的人都经历过失败和挫折。有些失败应当在预实验阶段发生，你这时能坦然接受。假如不做预实验，在正式的实验中遇到，你的挫折感就很明显。假如你因为赶时间而误操作，你会沮丧。假如你能因为目前心浮气燥而果断地放一放，就可以避免悲剧的发生。假如你早上进入实验室之前还不知道今天要干什么，你最好想好了再去。最大的错误是重复犯同样的错误。记住，屡教不改者不适合做实验。
06 当你的老板对你的实验的细节不太清楚或者你的老板在你的实验领域方面并不真正在行时，你特别要注意：当实验不顺时，没有预先期望的结果时，先不要过多去重复实验，特别是老板对你说：“要反复重复，多作！“，这时第一是先抠实验细节，特别是文献中一些没有注意到的细节或关键步骤，第二是对实验结果用不同的方法去证明，因为有时是已经有了预期的结果，只是被大量的背景所掩盖，而别的方法恰好可能从别的途径表达出来，第三要敢于否定老板判断，当然这一点在行动上很难，不过你可以在老板不在时去证明自己
07 先看综述，后看论著
看综述搞清概念，看论著掌握方法。
08 先看导师既往发表的文章，再看师兄师姐答辩的论文
看前者知道大方向（实际上应当在考他的研究生之前看过），看后者知道那些可以借鉴。
09 早动手
在师兄师姐离开之前学会关键技术。
10 如果接师兄师姐的工作往下做，一定要看其实验记录
前人的结果不一定可信！
11 两手准备
设计课题要为了阐明问题，即不论结果为阳性或阴性，都能写文章。阳性结果说明什么，阴性结果说明什么。 假如课题要求得出阳性结果，你可能要事先设计几部分，万一第一部分得不出预期结果，可以用其它部分弥补损失。
12 多数文章看摘要，少数文章看全文
掌握了一点查全文的技巧，往往会以搞到全文为乐，以至于没有时间看文章的内容，更不懈于看摘要。真正有用的全文并不多，过分追求全文是浪费，不可走极端。当然只看摘要也是不对的。
13 集中时间看文献
看过总会遗忘。看文献的时间越分散，浪费时间越多。集中时间看更容易联系起来，形成整体印象。
14 做好记录和标记
复印或打印的文献，直接用笔标记或批注。pdf或html格式的文献，可以用编辑器标亮或改变文字颜色。这是避免时间浪费的又一重要手段。否则等于没看。
15 准备引用的文章要亲自看过
转引造成的以讹传讹不胜枚举。
16 注意文章的参考价值。
刊物的影响因子、文章的被引次数能反映文章的参考价值。但要注意引用这篇文章的其它文章是如何评价这篇文章的：支持还是反对，补充还是纠错。
17 交流是最好的老师
做实验遇到困难是家常便饭。你的第一反应是什么？反复尝试？放弃？看书？这些做法都有道理，但首先应该想到的是交流。对有身份的人，私下的请教体现你对他的尊重；对同年资的人，公开的讨论可以使大家畅所欲言，而且出言谨慎。千万不能闭门造车。
一个实验折腾半年，后来别人告诉你那是死路，岂不冤大头？
18 最高层次的能力是表达能力
再好的工作最终都要靠别人认可。表达能力，体现为写和说的能力，是需要长期培养的素质。比如发现一个罕见病例，写好了发一篇论著；写不好只能发一个病例报道。比如做一个课题，写好了发一篇或数篇论著；写不好只能发一个论著摘要或被毙掉。一张图,一张表,无不是表达能力的体现。寥寥几百上千字的标书，可以赢得大笔基金；虽然关系很重要，但写得太差也不行。有人说，我不学PCR，不学spss，只要学会ppt（powerpoint）就可以了。此话有一点道理，实验室的boss们表面上就是靠一串串ppt行走江湖的。经常有研究生因思维敏捷条例清楚而令人肃然起敬。也经常有研究生不理解“为什么我做了大部分工作而老板却让另一个没怎么干活的人写了文章？让他去大会发言？” 你没有看到人家有张口就来的本事吗？
19 学好英语，不学二外。
如今不论去日本还是欧洲，学术交流早已是英语的天下。你不必为看不懂一篇法语的文章而遗憾，写那篇文章的人正在为没学好英语而犯愁。如果英文尚未精通，暂且不要去学二外。
20 SCI是个陷阱。
运气！有人没费力气发了一篇SCI文章。你不要羡慕他。因为据我所知课题是别人设计的，实验是别人手把手带他做的，文章是导师帮他找了国外的人改写的，而他并不擅长做科研。但是他因为一篇SCI文章已经自认为可以在科研的天地里一展身手了。于是要出国，要做实验，要继续发SCI,要挣美元。从此走上了一条不属于他的道路。（也许有酸葡萄心理的成分）。但是看看周围的人，看看自己，真的适合搞科研吗？
真的不适合搞科研吗?
21 实验技能只能是在实验室里“泡”出来的。
一个“泡”字道出了精华，很多人急于速成，但实验技能确实是“泡”出来的，所谓一份耕耘，一份收获。当年复旦大学的盛祖嘉教授花了15年的时间培养大肠杆菌，将大肠杆菌的属性摸得透熟，为以后的实验打下了坚实的基础，这份功力、这份耐心可能很少有人能做到。
我觉得实验课还是非常重要的，毕竟自己参加了而且亲手实践。实践中肯定是有问题的，既然自己没问题不见得别人没问题，而别人的问题也许就是你将来的问题。我想起码课前一定要认真预习，上课的时候要多“装聋卖傻”让老师在你想停的地方多说多做几次。讲完了别走，看看别人特别是没做完的和做坏的，帮她们解决问题，同时也提高了自己。
22 英文文章写作
1.阅读10篇文献，总结100个常用句型和常用短语。经常复习。
注意，文献作者必须是以英文为母语者，文献内容要与你的专业有关。
这属于平时看文献的副产品。
2.找3-5篇技术路线和统计方法与你的课题接近的文章，精读。
写出论文的草稿。要按照标题、作者、摘要、背景、目的、材料、方法、结果、讨论、致谢、参考文献、图例、图、表、照片和说明的统一格式来写。这样做的好处是从它可以方便地改成任何杂志的格式。
3.针对论文的每一部分，尤其是某种具体方法、要讨论的某一具体方面，各找5-8篇文献阅读，充实完善。
这里讨论的只涉及英文表达，也只推荐给缺乏英文写作经验的人。
4.找到你想投的杂志的稿约，再找2-3篇该杂志的article，按它的格式改写。
注意，每次改写都要先另存为不同的文件名，以免出了问题不能恢复。
5.找英文高手改。找不到合适的人，就去 http://www.oleng.com.au/ ，该公司提供英语论文编辑服务(English correction and improvement，not translation) ，在此向有钱没时间的人强烈推荐。我的同事从给杂志投稿到出版只用了2个月的时间，中间花＄200在这个公司改了一下英文，非常快。
23 文献管理
1.下载电子版文献时（caj，pdf，html），把文章题目粘贴为文件名。
注意，文件名不能有特殊符号，要把 \ / : * ? < > | 以及 换行符 删掉。
2.不同主题存入不同文件夹。文件夹的题目要简短，如：PD，LTP,PKC，NO。
3.看过的文献归入子文件夹，最起码要把有用的和没用的分开。
4.重要文献根据重要程度在文件名前加001,002，003编号，然后按名称排列图标，最重要的文献就排在最前了。
复印或打印的文献，用打孔器（￥10-15）打孔，装入硬质文件夹（￥10-20/个）。
24 我们经常会在参考文献的引用上耍一些小聪明，殊不知这些都会降低论文质量。
1.知而不引
明明借鉴了同行的类似工作，却故意不引用同行的类似工作，使自己工作看上去“新颖”“领先”。实际上审稿的就是同行。
2.断章取义
故意截取作者试图否定的部分来烘托自己的观点。
3.引而不确
没有认真看原文，引文错漏。
4.来源不实
某些字句来源不可靠(比如非正式的或非学术的出版物)，且不注明来源。常见于一些统计数字。
5.盲目自引
不是为了说明自己的工作与前期工作之间的关系，而是单纯为提高自己文章被引用次数而自引。
25 国内文章水平不高的几个原因
1.审稿人知识陈旧
年纪大的审稿人查文献和和上网的能力相当有限，无法核实该研究是否有意义，创新点在那里，方法是否可靠，结果是否可信。但匪夷所思的是他们经常提的审稿意见是“参考文献不够新”。
2.选错审稿人
虽然一般指定两名审稿人，但编辑部经常让不懂分子生物学的人审分子生物学的文章，让不懂统计的人审统计处理比较复杂的文章。出于爱面子，很少有人提出“我不适合审这篇文章”。
3.关系文章
有了关系，什么都简单了。
4.不承认阴性结果
诚实的阴性结果被认为无意义。怪不得有人大声疾呼“我要办一本阴性杂志”。
5.造假
任何人都不愿意成为制度的牺牲品。出不来预期结果就没法交差。为生存计，为按期毕业计，造吧。
26 动态的科研
1.科研靠积累。
象伦琴发现X射线那样凭借一次简单观察就得诺贝尔奖的机会越来越少。更多的科研成果来自于实验室长期积累。最终实至名归。做科研不要指望一步登天。设计课题不要好高骛远。基金评审也是这样。没有前期积累，获得资助的可能性小。选导师要想好：你是要白手起家，还是要为人作嫁？
2.文献要追踪。
开题时通过查文献了解的情况，到结题的时候可能有很大不同。实验过程中要注意追踪。运气好，你可以得到更多的线索；运气不好，发现别人抢先了。据此修正你的实验。写论文之前一定要重新查一遍文献。
3.记录要复习。
前面的实验记录要经常复习。随着经验的增加和认识的提高，你会发现最初的判断未必正确。
4.材料要变质。
随着时间的推移，有些试剂会降解，有些设备会老化，这导致你在完全按照以前的方法操作后得不到以前的结果。PCR是个魔鬼！很多人有这样的感觉。这只是一个简单的例子。如果某种试剂只是有效量的减少，你需要加大用量。如果变质以后产生了有害的物质，恐怕该换试剂了。如果设备读数有漂移，就得校正。总之，出了问题要找原因，每一步都要“确切”！否则就是刻舟求剑。 5.老板要看清。
老板也是摸着石头过河。他的想法随时在变。觉得事情不好，他会转向。你要擦亮眼睛，看清苗头，否则会被转晕。可以适当地引导一下。互动嘛。与时俱进！做好科研！[印象派 (2-8 16:48, Long long ago)]
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如何查找文献的全文(就算国大图书馆也不是所有journal买完的,还是用得上）注：由于大部分院校未能购卖国内外商业医学数据库，如PUBMED、ElseVier等，因而检索国外全文文献很复杂。这往往成为少数学校的专利。北大医学院网站上有大量文献题录，但仅供自已学生使用！这太可惜了，由于版权等多种原因，下面介绍一些可行的方法。
1、根据作者E-mail地址，向作者索要。
这是最有效的方法之一。为了更方便大家向作者索取原文，但一定要简洁！一般都愿意向你提供。下面是模板：
Dear Dr. (author name)
I would appreciate receiving a reprint of your article: ********(不必全写),杂志名 .However, this Journal is not available in our library.
Thank you very much for your consideration.
Respectfully yours,
Yourself name
下面是《丁香园》天天提供的模板，也可参考：信的内容如下：
Dear Mr./Mrs.: ________（作者名）I am a graduate student of Harbin Medical University in China. I major in "________"（您的专业）. Recently, I found one of your articles, titled "__________" （文章名）in Medline. I found it may help me achieve my goals in this research field. This would make a really positive contribution to my work. I would like to be able to read the full text of this article. The abstract makes the article sound very interesting. I know there is usually a fee required to obtain the full article from Medline; however, as a student, my only income is a small scholarship which is about U S $30.00 per month. I wonder if you would consider sending methe full text by Email. Perhaps you would consider this as an act of friendshipbetween our two countries.Thank you for your kind consideration of this request.Sincerely: ___________（您的名字）My Email address is: ____________________ （你的email地址）
11/16/2000
2、去 http://www.medcyber.com 医学空间网，提供全文检索服务。
用户在使用该网站的索取原文服务时必须注意以下事项：(1)在提供原文复印本时是使用扫描的形式，因此原文每页大小为100k左右，所以索取原文时需考虑到索取量。(2)考虑到索取文献的用户数量和原文复印本扫描件都非常大，因此每一位用户在索取原文复印本时，每日限制索取3篇文献。(3)本服务针对会员进行免费服务，如果您还不是会员，请马上免费申请加入。 在索取原文之前请查询您所索取的文献是否在收藏范围之内。 请您[下载]目前馆藏目录，以便您随时查询。另外健康大脑网也提供原文服务，给版主发e-mail。
3、按部就班，根据文章出处，去图书馆查找原文。当然去一些较大图书馆。
4、去Science网上杂志找文章。对中国人完全免费！
5、 High Wire Press 网站，斯坦复大学主办，文献量十分大，而且free!
Free Medical Journals，我的主页的中外期刊中有极详细的说明！
6 CNKI：中国期刊网提供三种类型的数据库，题录数据库、题录摘要数据库和全文数据库，其中前两者属参考数据库类型，只提供目次和摘要，可在网上免费检索，全文数据库需付费。目前对妇儿科免费。
由中国学术期刊电子杂志社开办的中国期刊网是目前国内最大型的学术期刊数据库，共收录有国内6600余种期刊的题录、摘要以及3500种期刊的全文。其中题录和摘要自1994年开始，全文目前只有1997年以后的，预计到2001年会回溯到1994年。每日更新。
中国期刊网收录的期刊均已有印刷版，电子版的速度要晚于印刷版。发行方式有两种：一是光盘方式，即CAJ-CD；一是网络形式，称“中国期刊网”，简称CNKI。光盘收入的期刊名可到三楼现刊室和参考咨询部查找。
http://www.cnki.net/http://www.chinajournal.net.cn
7、使用万方数据库 万方数据资源系统是中国科技信息研究所、万方数据集团公司开发的网上数据库联机检索系统，该系统每年可以提供共25个大类、74个数据库的网上检索，包括期刊论文、专业文献、会议论文、学位论文、科技成果、专利数据、公司及企业、产品信息、标准、法律法规、科技名录、高等院校信息、公共信息等各类数据资源。万方系统中有1000余种电子期刊，以理工科技类为主，全部是国内出版的中文和英文期刊，比印刷版略晚。http://www.chinainfo.gov.cn http://www.wanfangdata.com.cn用户名：wfqy09901 密码：935369
8、解放军医学图书馆 http://www.mlpla.org.cn包含的全文数据库有：Elsevier Science 、UMI 、SwetsNet 、EbscoOnline 每面邮寄1元（邮费另付）每面EMAIL3元
9、斯坦福大学HighWire出版社的电子期刊
斯坦福大学HighWire Press是著名的学术出版商，目前已成为全世界最大的、能够联机提供免费学术论文全文的出版商之一。它提供免费检索目次和摘要的期刊为192种，主要包括物理、生物、医学和社会学领域的核心期刊，其中有90种可以得到全文。
该站点上列出了所有可供检索的期刊名称，右边标识为free site的期刊是完全免费的期刊 ，可以看到数据库里任意卷期的全文；标识为free trail的期刊是免费试用的期刊，在一段试用期内可以免费得到期刊全文；标识为free issues的期刊是指不能看到最新出版卷期的论文，但可以回溯几个月以前或1到2年以前所有的过刊文章。
http://highwire.stanford.edu/
http://intl.highwire.org/
10、 好医生网站、37C提供部分全文
前者：可以提供免费的全文服务。天天去看了一下，果然不错，中文、英文期刊很多，而且更新得很快。英文的期刊有100种左右，多为核心经典期刊，而且摘要是中英文对照的。由此可见其匠心独具。如果想免费获取全文，就要先注册一下，这里一定要注意，要留下您的真实姓名、地址、电话等资料。因为网站要确认后才能承认您为正式会员，而只有正式会员才能索取原文。另外还要注意，每一个用户当天只能免费索取2篇原文。后者；收录从1998年至今国内的主要中文期刊的全文。非常好！但文献量还少了些。另外999也提供全文服务，但收费（所谓的金卡会员）
11 若要文章，可通过超星图书馆，从网易上下载超星图书馆专用下载器即可免费下载了！极好！您可免费下载十万种书，否则你也可以直接阅读。
12、如果作者有自己的主页，可以去作者的主页看看。不过一般查找作者的主页倒不容易！
13 利用搜索引擎：一般中文选用网易，对医学生物学内容收录较多，关键词：你所要查的文献中最专业的词汇 AND 材料与方法（因为这是一般论文通用格式）若为综述，加“综述”字样，效果还可以。
英文采用著名的搜索引擎，如Lycos，HotBot，Yahoo，我的主页的首页和文献检索中均有，输入详细的关键词（一定要具有特征性，防止搜索出太多的东西），末尾加PDF可能效果更好些。如查针刺治疗心肌缺血文献：myocardial ischemia AND acupuncture AND PDF，效果还可以。
14、在Medline找出原文后，点击Order就可以买到原文，价钱很贵呀。
15 中文文献，大多需要买，万方数据库、CNKI、999都是全文，请花钱吧，不过这样太没价值了。中文文献价值一般欠高！不建议个人购买！
CNKI中“期刊题录数据库”是免费的。找到医学类别，再输入关键词，检索结果出来后，可以获知文章的出处。内容之全，范围之广，更新之快，比万方数据库强多了。但就是不能免费查全文和摘要。如果你愿意交费也可以，大概是660元/月，看来除了单位之外没人愿意交费了。
16、 与复旦大学医学院图书馆联系，详情如下：
①利用我馆馆藏；②利用我馆Homepage上的电子期刊；③利用本市其它医药图书馆的馆藏(就近有二医、中华医学会、中科院图书馆)；④国内大陆没有的期刊，帮您通过“亚洲桥”或香港大学医学图书馆查找。 我们接到您的申请后，利用上述1－3途径可查得的文献，三天内便可将原文的复印件准备好，通知您或寄给您。具体收费标准为：利用本馆文献复印的每篇文献收查询费2元，从外单位复印的收查询费3元，复印费按各馆的复印价收。如果利用第4条途径查找，周期可能要长些，估计在一周到一个月左右。收费标准为：一次查询(不限篇数)收通讯费3元，复印费0.50元/页，另外每篇文献收查询费2元及实际邮费。如果没能找到原文，不收取任何费用。 您如果想同我们长期建立该项服务关系，可预先支付一定金额，建立一个帐户，费用以后逐次扣除。查询申请可通过书信、电话、传真或E-mail形式。联系人： 周月芹 曹岭
联系电话： (021)64041900 X 2722传真： (021)64037222联系地址： 复旦大学医学院图书馆八楼 E-mail: ill@shmu.edu.cn
17、 重庆维普资讯公司
收录有中文报纸1000种,中文期刊12000种,外文期刊4000种,拥有固定客户2000余家。维普有两种注册用户，一种是可以查阅全文的，这种是要收费的。 另外就是一般注册用户，是使用免费资源的，比如全文检索，讨论版等等。 收费用户中采用包库方式的机构用户或个人，我们将在年末附送期所包库的光盘版作为保存用。 流量计费的用户在累计一定金额后，我们将增送使用时间或是光盘版。同时提高其会员级别，将获得更优惠的使用费用。
18 免费中文全文检索：超星读书试用卡19.其他
全国医学文献信息中心（北京医科大学图书馆）
http://library.bjmu.edu.cn
可以查全国西文医学期刊联目
国家科技图书文献中心
http://www.netdoc.gov.cn
http://www.nstl.gov.cn
地址：复兴路15号，电话和传真：68515023
美国神经放射学杂志
http://www.ajnr.org/searchall
[印象派 (2-8 16:51, Long long ago)]
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(引用 印象派:科研生活及其习惯科研生活及其习惯
目录：
一、研究生生活和现状
二、做好计划
三、研究过程中的注意点
四、如何查阅文献
五、如何作实�...)科研随想录“诸君到大学里来，万勿存心只要懂了一点专门技术，以为日后谋生的地步，就算满足，而是要为拯救中华做社会的砥柱。”
——竺可桢
1、民营企业家的精神
真正做学问，是要一种精神的。民营企业家有种为自己干活的务实精神，有种猛冲猛打、锐意进取、死死咬住项目不放的精神，有一种从早干到晚、星期天也不休息、有家不回有孩子不抱的精神，是现在的研究生做科研所缺乏的。学生不是老板的打工仔。不要把自己默认为老板的打工仔，如果把自己默认为老板的打工仔，则不能真正发挥自己主观能动性，不利于培养独立工作能力。老板是董事长，手下的学生应该把自己默认为项目经理，要把老板交给自己的工作真正当作自己的事情，真正落到实处。要独当一面，做好可行性分析、项目设计、药品管理、经费管理、时间管理和文字处理，在科研中培养管理能力和独立工作能力。充分发挥主观能动性，做不好实验，连觉也睡不着，中午也不要休息了。只有有这样的心态，才能做好科研，否则把自己当作国营企业职工，下班铃一响就吃饭，今天没干完的事情留到明天去做吧，实验做不好就做不好，自己也不急，只顾自己打游戏上网看录像，这样怎么能做出出色的科研呢？
总之，我的观点是：民营企业家的那股锐气，那种为自己干活的精神，那种死死咬住不放精神，对于做科研的人来讲是有很大启示作用的。科研和管理其实有很多相通之处.
2、对出文章态度的再认识
一个人对钱的观念和文明程度会随着拥有财富的增加而变化。我从小生活在贫民区，那里的人很穷，越是穷的人越是把一点钱看得比什么都大，涉及金钱利益的时候非常斤斤计较，看电视不开灯，冲马桶用掏米洗菜水，热死不乘空调车，在菜场里为了便宜五分钱还要讨价还价老半天，临走前还趁人不注意从摊贩那里捞上一把。子女为了房子展开激烈争夺的屡见不鲜！而当一个人有一千万的时候，对钱的认识和文明程度会有新的变化，人们会为了成就感而工作，为了自己的兴趣爱好而工作，而不是为了吃饭而工作。人们会更加慷慨，更加心胸宽广。至于象李嘉诚那样，就更是一种新境界了。
同样，我对出文章的态度也随着出文章数的增加而变化。没有文章的时候很喜欢出文章，觉得文章多很扎台型，现在不是到处搞攀比吗？为了出文章，据复旦校报上讲，现在很多人不是流行一篇文章拆成三篇来写吗？不是流行“快报+长文章”吗？评奖学金不是要文章吗？出国不是要文章吗？以前有人批评我的文章是短文章，我忿忿不平地说：“短文章也是文章！有总比没有好！”，但是随着文章数的增加，我觉得文章多又不能当饭吃。如果我要出国，那么两页的中国文章也拿不出去啊。如果我将来要当教授，那么底下的评委又不是傻瓜，文章档次当然很重要。看了外面一些学校一些人的博士论文最后一页“文章发表目录”，发现有的人文章很多，三十几篇，但都是名字也没有听到过的杂志和会议论文，而且一大半都是第10作者，一篇外国文章也没有。这样的“文章多”，给人一种什么感觉呢？
随着阅历的增加，我更多地接触了Journal of Catalysis上的文章，更多地了解了我的美国老板——Zaera教授文章和老板的老板—Somorjai的第一流的文章。Zaera的文章并不多，一年只出10篇，起初我带着一些嘲笑的眼光看这个数字“10篇”，但是查到原文，发现这所谓“10篇”，真是一篇抵得上中国人10篇，文章长得不得了，每篇文章印出来15-20页左右，数据多得难以想象，讨论占文章长度的1/2。至于内容，更是有意义的。看了这些文章，的确对我出文章的态度产生很大影响，即：我希望我将来的Paper List上都是长文章，都是高质量的文章，这也是中国老板经常教育我的。
3、两种不同的科研风格
我们实验室今年有两个人出国——我和我师兄。我们从主观上讲都想搞好科研，但我们的科研风格，是两种各有千秋的风格。
我师兄是那种沉得住气的人。他喜欢做那种难度大得惊人的课题，而对“不做也能想象得出大致结果”的课题显然不感兴趣。他可以容忍一年甚至更长时间实验毫无进展，他能够忍受成百次的失败，他能从容不迫地坚持做实验到硕士论文写作前几天，他能卧薪尝胆待业考托福GRE联系出国。
而我的科研风格，受做生意影响很大。6-7年前的两个暑假，我在舅舅的公司当销售员。做零售就是这么一种心态，就是“每天要确保营业额”，如果今天没有什么生意，宁可降价也要确保营业额，如果当天不完成一定的营业额，心里很是不安，如果几天没有做到生意，更是急死了。做生意还有另外一种心态，就是总归拣好做的来做，不好做的不做。于是，到目前为止，我的科研风格就是喜欢做那些每天都有数据进帐的实验，哪怕是机械操作。我不大喜欢做难度大得惊人、连影子也没有的课题。我倒比较喜欢做工作量大得惊人，但至少能做出来、每天都有收获、每天都知道明天该做什么的课题。
我师兄和我科研风格的不同，除了和彼此个性有关以外，可能和专业特点有关。他搞的是材料合成，我搞的是催化。材料合成要动脑子的，失败的可能性大；而催化是“苦功型”的。你说真正有多少特别的创造发明在里面？很少有。催化就是不厌其繁地做做做，焙烧温度的影响、负载量的影响、稳定性考察，或者是TG结果、TEM结果、XPS结果、IR结果、XRD结果、反应测试结果......
我难以区分这两种科研风格，哪种更好些。也许我们以后也要做生意的，这两种风格照样还会体现在彼此的做生意风格中......
4、发表文章和积累
很多同学都希望出引用因子高的文章，其实出文章也有积累效应的。催化界文章的最高境界是Journal of Catalysis，这个杂志并不是随便投投就一投即中的。在Journal of Catalysis发表文章是需要工作积累的。这包括两层意思：一层是在这个课题上做过很多铺垫性的工作，获得了很多经验，在自己经验和积累的基础上，在自己体会深刻的领域，往往能够取得突破；第二层意思是你在这个领域做多了，发表了很多文章，到最后这个领域的专家都认识你了，知道你的工作的系统性、可靠性和对这个领域的重要性，那么给予发表乃是顺理成章的事情了。即审稿人就是搞这一行的，也看人头的，也知道做这一行有这么个小有名气的人，而假设一个“某某师范高等专科学校教务处”的名字也没听到过的人也来投这个杂志，多半是退稿；如果审稿人是大同行而不是小同行，也会看投稿人的“参考文献”部分，以前有无在这个领域发表过文章，在这个领域的国际杂志上发表很多系列工作的人比什么也没发表过的“新面孔”录取机会高得多。
2000年，我们课题组实现了Journal of Catalysis零的突破，而为了这个零的突破，我们在固体超强酸方面做了10年的铺垫，形成了一套成熟的催化剂制备、表征方法，搭好了装置，并熟透了文献。10年来发表了一系列工作，逐渐从国内走向国外，工作被国外多篇REVIEW引用，国外一些做超强酸的大家也来函索取发表在中国杂志上的文章。正是在这样一种好氛围的熏陶下，才能够形成一定的飞跃，厚积才能薄发。当时设想我们组如果能有突破的话，最有希望在这个领域突破，可以说那篇Journal of Catalysis是偶然中的必然。一回生，二回熟。同一个杂志投多了，编辑也知道你投过来的稿子都是很有意思的，而不是“戳一枪”混一篇文章。老客户了嘛，因此就很好通过了。这也是一种累积效应。
5、“废数据”
大家硕士毕业了，完成了薄薄的一本硕士论文，但是回过头去想想，这三年里面，人也天天在实验室，但是为什么硕士论文那么薄？吉林大学徐如人小组的学生人人出一堆文章，而我们为什么出文章那么慢？大家一样在做实验，但是我们的数据的“有效利用率”是多少呢？起码1/3-1/2的的数据都是废数据！科研是要能够耐得住失败的，但是很多失败都是自己主观原因造成的！
首先，不看文献不做实验。不要文献也不查查好，急着做实验想一星期出篇文章，结果做了老半天，再看看文献，发现几年前别人已经做过了。或者文献的实验部分也不看看清楚就做实验，等到写文章了才发现自己的反应条件全部都是错误的，全是废数据。还有，文献也不看看清楚，等实验做完了才发现自己的结果和前人结果有严重矛盾，自己又不是什么一言九鼎的催化大师，写好的文章也只能往垃圾桶里扔了。
其次，药品纯不纯啊？不要跟我说你从实验室角落里随便拿了一瓶什么“1970年国营**化工厂”的药品来做实验噢。在有些精细的实验中，即使是买来的“分析纯”的药品，都要事先检验纯净度的。提纯是难免的。别到了最后才发现药品不纯，结果做的数据全废了。
再次，不要节约用钱啊。在家里不要把水龙头拧成滴水成线而水表不转的状态，在实验室不要把气相色谱记录仪的走纸速度调成只出峰面积而不走纸的状态。光看峰面积，你叫我如何判断这个数据有用没用？假设基线没走稳，则数据没用，但是如果记录仪不走纸，我如何判断基线有无走稳？善于观察的人能发现新现象，实验中往往能发现微量的新物种，这些物种对判断反应机理有重要作用。比如有人发现在固体超强酸催化烷烃异构化中有微量烯烃生成，于是新的反应机理就突破了。而假如你把气相色谱的最小峰面积设得很大，那么你怎么判断有没有新物种生成？如果有，量又是多少？
还有，实验条件事先设计好了没有啊？不要对我说你的这个系列催化剂负载量是10%、20%、30%、40%，而那个系列催化剂负载量是0.1、0.2、0.3、0.4g/g载体噢！这两种计量方法是不同的，在同一篇文章中出现两种计量方法是非常可笑的，把一种换算成另外一种，就会带来“负载量为9.09%, 16.67%, 23.08%, 28.58%”这样难看的数字。而且两个系列催化剂之间根本无法对比，因为它们的计量是不同的。
做实验还真是一门学问，没有猛干精神不行，光有猛干精神更不行。“多动脑筋少动手”，不错不错！！
6、出文章秘诀
系里规定硕士毕业要一篇SCI，博士要两篇SCI，能否完成？很多同学愁眉苦脸怕完不成，其实是不知道“行情”，吉林大学、大连化物所、南京大学有些牛人的学生，出起文章来速度很快。博士毕业10篇外国文章都不希奇。出文章，的确有窍门！别的我不敢说，我来说说催化吧！
首先，“鲜花需要绿叶陪衬”，你研制出一种好催化剂，你就要拿10种不做也知道没有活性的催化剂来衬托它的好。大家都是这么做的，否则审稿人就会说：“空白实验做过了吗？不加催化剂有没有活性啊？你的二元金属氧化物活性很高，你和它们各自的母体氧化物比较过吗？不比较你怎么证明二元比一元好？你的是二元固熔体，你做过二元氧化物机械混合的催化剂吗？你的是Si-Al，你做过Si-Ti吗？你做过Si-V吗？你怎么知道Si-Al最好？还有，你的催化剂和文献报道的最好的催化剂比较过吗？退稿！！”
其次，数据越多越好，有些东西也许是你不做也知道的，但是不能因为不做也知道规律而不做，越是做得出的东西越是要做。文章里不能老是有标新立异的东西，大路货也要有，这是文章的血，这是文章的肉，这是稳拿的数据，这是体现工作量的，没有功劳也有苦劳。比如外国催化大师做杂多酸铯盐的新反应，每开发一个新反应，自然先要把杂多酸铯盐表征一番。这种东西不做也知道什么样，但做了更好。XRD，红外，热重，酸量......这种稳拿的数据先做好，然后做一个别人从来也没做过的反应，就可以发篇好文章。还有，外国有的人机械研磨法做LiMn2O4尖晶石，用来做电池。那种文章很好出。要是轮到一些不会混文章的人来做实验，准保是“一点法”，即给出一个最佳配方，然后测测电化学性质。那个外国人会做，他考察了研磨时间的影响：不研磨、研磨2,4,6,8,10,小时，看它们的XRD、比表面、TEM变化，很有规律；然后考察了焙烧温度的影响：不焙烧、200，400，600，800，1000，1200度焙烧，看它们的它们的XRD、比表面、TEM变化，很有规律，并用TG/DTA和前面结果关联；最后考察了样品的电化学性质，就出了篇好文章。
这可不是投机混文章，这是科学的严谨态度！这是不厌其烦！！很多科学家都是这么做的！！比如Surface Science上面很多文章都是这么做条件实验的：改变吸附气体的吸附量，改变脱附温度......
要想出长文章就是要苦做，数据往多里做，文章往长里写。想省力，最好做两个星期就出篇文章反而适得其反。做实验不一定是速率决定步骤，审稿才是。与其数据不丰满而被退稿，来回四个月过去了，还不如静下心来把数据补补全，把文章写写好。把工作量调整到正好够发“某某学报”的程度而把工作嘎然而止是可惜的。要“法乎上，取其中”，数据能充实尽量充实，文章能丰满尽量丰满。
还有，写文章要“你有我有大家有”，充分引用他人工作。这可不是拍审稿人的马屁。文献没有引用好只能说明你文献把握不全，不能正确领会这个课题的意义和动向。另外，数据规律也要和别人大致吻合，提出一个观点要能找出三篇文献来证实我的观点，这是一种保险文章的写法。如果实验现象反常而没有合理解释，那只有退稿的份了。老实说很多文章都没有特别大的新异，要全文通篇有新意很难。中国人发发文章，往往是催化剂和别人不一样，但规律和前人的工作基本吻合，那也就可以了。
7、合作精神
是不是希望写文章的署名栏人越少越好啊？一开始我也是这么想的，但是时间长了，第一作者的文章多了，就不这么想了。
有些人真把天下看成漆黑一片，仿佛天下老板都是什么事情都不做而挂名的。我当然不赞成随便挂名，但至少在复旦，主流还是好的嘛！现在的老板又不是傻瓜，他不会随便给别人挂名而去冲淡自己的贡献。对所谓“挂名”的态度，表面上打着“反对挂名”的旗号，实际上是拒绝合作。表现在实验中拒绝和别人交流讨论，怕别人知道自己的实验情况，有些实验明明可以叫别人轻车熟路帮忙做一做，却偏偏要自己活受罪从头学起耽搁了实验进度，为的就是少署个名字；有的表征明明可以去做，做了有助于提高文章质量，把蛋糕做大，但自己的私心在那里作怪，怕别人“篡党夺权”而忍痛割爱不去做表征。以上都是“岛国文化”、小家子气，钻进小楼成一桶，一辈子都走不出自己的这个圆。
年轻人，把什么署名先后拉，什么署多少人拉看得那么种有什么用？你要评院士，你并不会因为这两篇文章而评得上；你要找工作，回过头想想文章又有什么用，赚点钱不比你发篇文章强啊？不要老是把文章看做是自己的私人财产，没有课题组的积累，哪来的个人成就？没有人帮你搭仪器装置，没有人帮你测试样品，哪来的你的文章啊？理科不是文科，不是你坐在小房间里看看书动动脑子文章就出来的。这样私心这么重，这样怕合作（因为一合作，就必然涉及到作者名单的增长），以后谁还来和你合作啊？
8、文献是个宝
不读文献不做实验。否则，一是做了老半天发现别人做过了；二是做了老半天发现实验条件都是错误的。做了也白做。文献读一遍是远远不够的，每读一遍都有新的收获。初次接触一个课题，往往看文献如坠入九里云雾中，不能深刻体会其精髓和实验细节的奥妙之处，只留连于具体的实验结果；做了实验，碰到难题了，回过头来再去分析、比较、仔细体会，方知奥妙之所在，对这个课题才会有更深的认识；等到写文章了，再看看文献，比较自己和文献的结果，庞征博引，使感性认识上升到理性高度；文章发表了，自己的文章也成了文献大海中的一朵小浪花。
只有做了实验，才会真正读懂文献。也就是说，如果要写综述，自己没有做过这个课题，很难写好综述。而一旦读了很多文献，又做好了实验，研究生还是完全有能力写一篇综述的。很多同学抱怨出文章难，其实文献不能白看，看看文献也能在中国杂志出篇文章呢。这篇文章又可以算硕士论文第一章，真是一举两得。
9、老板剥削论？
我曾经说过到国外去干活，做出成绩都是老板的，这是剥削；别人还对我说我们研究生做实验，发表专利算老板的，不合算云云。其实我脑子早就变了，没有什么“被剥削”的概念。
首先，出文章对你自己的前途有好处啊。出国看文章，我回国当长江学者黄河教授也看文章啊。没有老板的正确指导、流利写作和把关，没有老板的名字做招牌，你一个人能达到这种效果吗？老实说外国某教授的有些文章，是学生做实验老师写文章，在这种情况下即使老师挂第一作者也很正常嘛！！什么“剥削”啊，“剥削”啊。你看看那些文章嘛，讨论占一半以上！！没有老师那支笔、那个脑袋、那个名字，文章只能往低档次里投了。学生这样被“剥削”还是合算的。
其次，干活培养你自己的能力啊。老板经常教诲我要热心公共事物，要做得多，手要勤脚要快，勇挑重担多做“额外”的事情。对于好学生就是要压担子，做得越多就越熟悉，就做得越快，别人赶也赶不上。几年来我深深感到老板的话是对的，我也在努力地做事。哪怕是跑跑财务科、采购采购仪器照样可以接触更多、培养能力！我的能力提高地飞快这些能力是抢也抢不走的。老板也非常乐意做很多“额外”的公共事情，同样是速度飞快，越做越快，任何人都赶不上。
再次，老实说学生发表几篇文章，出了专利，本来就不产生什么巨大的经济效益。一般的，发表也只是发表了，所以剥削也无从谈起。做学徒就是要做的，脑子里不要有“被剥削”的感觉，才能学到真本事为我所用。三年研究生，你说你被老板剥削了，其实也未必，你也在为你的将来打造资历（文章）和能力（经验）的基础，这是千金不换的。特别是后者，一辈子受用啊！！
也许有的人说我中毒了、着魔了，可我要说只有经历了，才真正会有体会——多做没错。
10、一体化理论
看来现在很多同学和老师的观念需要更新。如前文所说，科研中需要一种民营企业家精神。如果把这个观念再外推，就成了一体化理论，即：（1）科研和生活一体化；（2）科研和学习一体化。
（1）科研和生活一体化：不严格按照国营科研单位“坐班时间”，而是跟着实验安排自己的休息时间，围着仪器转。仪器一转，午饭都可以不出去吃而呆在实验室一边看着仪器一边吃干粮；今天下午实验做完了，哪怕是“上班时间”照样可以回寝室睡上一觉，养足精神晚上好看文献动脑筋。或者可以去家乐福采购点东西，反正早晚都要采购的，现在有了“货物储备”，过几天就可以不去采购而安心做实验了。别人休息星期天，我偏要休息星期五而星期天工作，因为这时候仪器空闲。绞人多，仪器挤，走廊里电话响个不停，真是吵也吵死了！
（2）科研和学习一体化：我的论调是在实验室里看TOEFL、GRE也没有什么不好的。这是年轻人积极奋发、志向远大的象征，总比在寝室里搓麻将或者在花园里搂搂抱抱强吧。一边看TOEFL、GRE，一边实验做得呱呱叫的人确有其人（不是我）。特别是对于催化实验，不就是半小时打一针吗。这是苦力活，从早做到晚。总不能叫我守在仪器旁边干坐着吧，看看英语，很正常嘛！再说暑假寒假，本来可以休息的，现在在实验室开着空调一边半小时打一针一边看我的英语书，公私兼顾嘛！！文章也出了，英语也看了，一举两得嘛！
现在很多老板都想通了。不让我看GRE我不来了，或者出工不出力，或者出一堆废数据浪费药品仪器，这不两败俱伤吗？再说现在出国的人希望多出文章好出国，不出国的人混篇文章毕业就行了。所以阻止学生出国是种荒谬的想法，不利于学生，也不利于老板效用最大化。
11、能垒效应
对于刚开始搞科研的人来说，绝对存在能垒效应。有的人做出成果的活化能大一点，有的人小一点，这和自己自身的功底有很大关系。基础没打好，活化能特别大，甚至连英语阅读、文章写作、图表绘制都会成为能垒的一部分。老师是催化剂，可以降低活化能。学生一旦开窍，再加上自己用心，就一发不可收拾。第一篇文章最难写，一旦突破能垒，以后投外国文章不再是不可逾越的鸿沟。
12、科研逆境
科研逆境是不可避免的，是我们所不愿意遇到的。本命年的时候我遇到过科研逆境，而且还是在科研顺境之后的科研逆境，其对比反差之强烈，令我寝食难安——整整一年都没有实验进展，在实验室里晃来晃去就象光吃米不下蛋的鸡。我选择了放弃那个课题，另起炉灶。
实验室里，谁没有走过弯路？少则半年，多则一年。有时候调仪器调了半年都没有调好，有时候做了一年都没有得到任何有价值的数据。我曾经问师兄，有没有遇到科研挫折，遇到了以后是如何消除的。他说的确遇到过，挫折就放在那里，做着做着就自然消除了。
老板绝对不是那种随随便便就允许放弃的那种人。“活要见人，死要见尸”，你说实验遇到困难了，无法贯彻下去了，准备混过去了，老板就一定要知道为什么做不下去，而不是你说另起炉灶就另起炉灶。因为你做了几个月放弃了，那么即使你换了课题，说不定又做了几个月又放弃了，这就表明不是实验课题难，而是实验者自己的问题。在老板这种契而不舍的督促下，原先已经“做死”的很多题目没有被放弃，死死咬住，反而又获得了生机。这使我明白：实验逆境并不是不可逾越的，科学总是科学，该做得出的总归做得出，尽管存在能垒。如果做不出，也要明白为什么做不出，“活要见人，死要见尸”。静下心来好好分析实验失败的原因，静下心来做一做，而不要有急着“赌输了急着翻本”的心理，那么最后总归是做得出的。
13、失活和再生
我是研究催化的。催化剂有失活和再生，而作为科研主体的人，同样也有“失活和再生”现象！
科研者不是金刚，研究做长了在某段时间内会有“失活”现象，人累了，心倦了，灵感没有了，一拿起烧杯就厌烦。这就象谈恋爱时间长了，天天在一起，该干的事情都干了，就觉得不过如此，一点意思都没有了。
做一个课题，绝对需要一鼓作气，设计实验的时候宁可做全一点，不要“敬酒不吃吃罚酒”，等到退稿了才去补数据。这时候一种厌倦的心情油然而生，“又要补数据啊”，而且仪器工作也改变了，仪器也坏了，实验结果和一年前做的不一定有精确的可比行性。
长时间没有实验结果导致毕业压力大，同样也会产生“失活”现象，拿起烧杯的时候就想“别又是一堆废数据”，对科研彻底失去信心。再加上看看其他同学文章多，导师又催得紧，心理压力就更大了。
科研热情的“再生”，有时可以通过“偏离”(deviation)，即离开实验室，不去想任何实验问题，到外面社会上去走走看看，做不出实验就休息一段时间，让脑子充分地放松，然后再回到实验室做实验，有“小别胜新婚”的效果。
可是，这种“再生”是“引发剂”，如果还是做不出东西，科研热情还是会熄灭。最好的再生是：做实验走上正轨，每天都出有用的数据，文章雏形更加清晰，这样的科研是不会疲倦的。
我曾经“失活”过，后来又“再生”了。最好的实验安排，是整理完一篇文章，然后自由休息半个月。这半个月的休息比在实验室里继续泡着效果好得多。休息，是为了更好地工作。
14、出文章和成就感
歌星以新专辑层出不穷为成就感，民营企业家以开了10个公司为成就感，而我从出文章中获取成就感。
《封神演义》中总有这样情节：“敌方”布下夺命的阵，“我方”一开始总是肉包子打狗有去无回，这时总有得道的仙人从容应对，凭着一朵莲花也能如入无人，任阵势险恶，能耐我何?
投外国文章也是这样的。混篇中国文章很容易的，随便做做就有了；可要出篇外国文章需要很大的努力，要憋着一股气，做上半年才能实现。看中国多少人在国内杂志号称“首次发现......，突破了外国文献公认的观点”，可是这些人中国文章一大堆，还号称催化大师，怎么连篇外国文章都没有？所以，如果能达到投外国杂志指东打东，指西打西的境界，也是一种从容。为人所不能为，则有成就感。
想想有些学校凭借三篇《化学学报》也能评个教授，难得出个《**师院学报》也要争先恐后地挂名，视其为油水，在复旦这么浓郁的科研气氛中成长，在不同的起点进步，我怎么没有成就感呢？这种成就感超越了工资的需要，超越了“出篇文章够毕业就行了”的态度，成为了我科研的驱动力之一。老实说，以出文章为科研驱动力之一也是正常的，真正“为了科学而科学”，做了实验只是自己探索科学奥妙而不发表的人绝对是少见的。
最美丽的景色往往在最险峻的地方，自己征服了最险峻的地方才会有成就感，而花钱雇别人抬我上去，或者仅仅从照片上看到则没有这种真实的感觉。对于出文章，只有自己“为伊消得人憔悴”，在艰难中杀出一条血路才会体会到真正的成就感。所以，我是不喜欢互相交换挂名的。不做实验而交换挂名，文章是多，但是当文章一大堆的时候，那些第三作者的文章又有什么用？把我真正花力气辛辛苦苦做的第三作者文章都淹没在文章堆里了！
15、科研的心理屏障
以前前进GRE教材第一篇文章就是方守成的文章，他指出以前从来没人考过2000分，所以大家都认为自己考不过2000分，以至于诱导了你的复习和临场发挥，最终果然不过2000分；自从第一个人过了2000分，以后又有一群人过了2000分，于是大家都认为考2000分如屡平地，冲破了这个“心理屏障”，所以人人都超过了2000分。
我们复旦化学系绝对存在心理屏障。评奖学金的时候谁文章稍微多一点，下面的先生就跳出来说“不正常”云云。而在实验室里出文章有“极限效应”，这个极限是12-13篇。一般的博士出个三五篇文章以后，“心理屏障”效应就开始发挥作用了，不再向极限冲刺。
其实，你要是看看外面的科研单位，如今的那些杰出青年、长江学者在当年做博士的时候就显现出来了。南京大学毕业的金国新，戴安邦院士的学生，博士论文219页，博士期间发表文章第一作者20篇；大连化物所毕业的肖丰收，郭燮贤院士的学生，博士期间发表第一作者文章16篇；大连化物所毕业的赵东源，郭燮贤院士的学生，博士期间发表文章15篇；吉林大学徐如人院士的学生，个个文章一大把。
达到这样的高度没有什么“不正常”的，我们复旦完全能达到同样的高度，很多时候是“心理屏障”在作祟而阻挡了前进的脚步。有种人做实验有股“凶”劲，杀气腾腾，死死盯住不放，猛冲猛打、掘地三尺，抱定“与众不同”的决心，对自己高标准严要求，这样就可以达到以上各位同样的高度了。
[印象派 (2-8 16:52, Long long ago)]
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(引用 印象派:科研生活及其习惯科研生活及其习惯
目录：
一、研究生生活和现状
二、做好计划
三、研究过程中的注意点
四、如何查阅文献
五、如何作实�...)科研体会 1~81
我做科研的几点体会
1.一半时间做实验，一半时间看文献。
千万不能把时间全部消耗在实验台上。看文献、看书、看别人的操作、听别人的经
验、研究别人的思路，边做边思考。要学会比较，不要盲从。否则，会被一些小小的问
题困扰许久。
2.准备越充分，实验越顺利。
古人云，磨刀不误砍柴工。前期的知识储备、文献储备、材料准备、方法准备可以
避免手忙脚乱，充分的预实验使你充满信心。一步一个脚印，就不必“从头再来”。最
不能容忍的是在开始的几步偷懒，造成后面总有一些无法排除的障碍。
3.记录真实详荆
人总是有一点虚荣心的。只把成功的步骤或漂亮的结果记到实验记录里，是很多人
的做法。殊不知，许多宝贵经验和意外发现就这样与你擦肩而过。客观、真实、详尽的
记法。殊不知，许多宝贵经验和意外发现就这样与你擦肩而过。客观、真实、详尽的
记录是一笔宝贵的财富。
4.不要为老板省钱。
效率为先。整天算计着省钱，一旦用了不可靠的东西，只会浪费时间，遭受打击，
到头来一分钱也省不了。
5.把握心理优势。
假如不做预实验，在正式的实验中遇到，你的挫折感就很明显。假如你因为赶
时间而误操作，你会沮丧。假如你能因为目前心浮气燥而果断地放一放，就可以避免悲
剧的发生。假如你早上进入实验室之前还不知道今天要干什么，你最好想好了再去。最
大的错误是重复犯同样的错误。记住，屡教不改者不适合做实验。
科研体会2
1.先看综述，后看论著
看综述搞清概念，看论著掌握方法
2.先看导师既往发表的文章，再看师兄师姐答辩的论文
看前者知道大方向（实际上应当在考他的研究生之前看过），看后者知道那些可以
借鉴
3.早动手
在师兄师姐离开之前学会关键技术
4.如果接师兄师姐的工作往下做，一定要看其实验记录
前人的结果不一定可信！
5.两手准备
设计课题要为了阐明问题，即不论结果为阳性或阴性，都能写文章。阳性结果说明
什么，阴性结果说明什么。
假如课题要求得出阳性结果，你可能要事先设计几部分，万一第一部分得不出预期
结果，可以用其它部分弥补损失。
科研体会3
.多数文章看摘要，少数文章看全文
掌握了一点查全文的技巧，往往会以搞到全文为乐，以至于没有时间看文章的内容
，更不懈于看摘要。真正有用的全文并不多，过分追求全文是浪费，不可走极端。当然
只看摘要也是不对的。
2.集中时间看文献
看过总会遗忘。看文献的时间越分散，浪费时间越多。集中时间看更容易联系起来
，形成整体印象。
3.做好记录和标记
复印或打印的文献，直接用笔标记或批注。pdf或html格式的文献，可以用编辑器
标亮或改变文字颜色。这是避免时间浪费的又一重要手段。否则等于没看。
4.准备引用的文章要亲自看过。
转引造成的以讹传讹不胜枚举。
5.注意文章的参考价值。
刊物的影响因子、文章的被引次数能反映文章的参考价值。但要注意引用这篇文章
的其
2.集中时间看文献
它文章是如何评价这篇文章的：支持还是反对，补充还是纠错。
科研体会4
1.实验课学不会实验
实验课之前老师把前面的步骤做完了，把所有问题都解决了，上课的时候让大家见
到完美无缺的最后一步的表演。这是真正的实验吗？那时候我们还天真地问老师：我们
可以走了吗？什么时候交实验报告？
对多数人来说，实验技能只能是在实验室里“泡”出来的。
2.交流是最好的老师
做实验遇到困难是家常便饭。你的第一反应是什么？反复尝试？放弃？看书？这些
做法都有道理，但首先应该想到的是交流。对有身份的人，私下的请教体现你对他的尊
重；对同年资的人，公开的讨论可以使大家畅所欲言，而且出言谨慎。千万不能闭门造
车。一个实验折腾半年，后来别人告诉你那是死路，岂不冤大头？
3.最高层次的能力是表达能力
再好的工作最终都要靠别人认可。表达能力，体现为写和说的能力，是需要长期培
养再好的工作最终都要靠别人认可。表达能力，体现为写和说的能力，是需要长期培
养的素质。比如发现一个罕见病例，写好了发一篇论著；写不好只能发一个病例报道。
比如做一个课题，写好了发一篇或数篇论著；写不好只能发一个论著摘要或被毙掉。一
张图,一张表,无不是表达能力的体现。寥寥几百上千字的标书，可以赢得大笔基金；虽
然关系很重要，但写得太差也不行。有人说，我不学PCR，不学spss，只要学会ppt（
powerpoint）就可以了。此话有一点道理，实验室的boss们表面上就是靠一串串ppt行走。
经常有研究生因思维敏捷条例清楚而令人肃然起敬。也经常有研究生不理解“为
什么我做了大部分工作而老板却让另一个没怎么干活的人写了文章？让他去大会发言？
”你没有看到人家有张口就来的本事吗？
4.学好英语，不学二外。
如今不论去日本还是欧洲，学术交流早已是英语的天下。你不必为看不懂一篇法语
的文章而遗憾，写那篇文章的人正在为没学好英语而犯愁。如果英文尚未精通，暂且不
要文去学二外。
5.SCI是个陷阱。
运气！有人没费力气发了一篇SCI文章。你不要羡慕他。因为据我所知课题是别人
设计的，实验是别人手把手带他做的，文章是导师帮他找了国外的人改写的，而他并不擅
长做科研。但是他因为一篇SCI文章已经自认为可以在科研的天地里一展身手了。于是
要出国，要做实验，要继续发SCI,要挣美元。从此走上了一条不属于他的道路。（也许有
酸葡萄心理的成分）。但是看看周围的人，看看自己，真的适合搞科研吗？
真的不适合搞科研吗?
科研体会5
我不知道科研对造假能够容忍到什么程度，科研和造假是不是一对双胞胎。
但台上的人都在说－决不造假。
1.适当造假：无关痛痒，偏差不大。
论文中做了年龄、性别匹配的正常成人DNA对照，实际用脐血DNA做对照；论文
中正常对照做了200例，实际做了150例；论文中有显著性差异，实际也有显著性差异，
但均值的差别没有论文中那么大；论文中随机分组，实际上随意分组；论文中给动物行
无菌手术操作，实际是只把部分器械在消毒剂里泡了泡。
2.被动造假：忍辱负重，有苦难言。
师兄的论文发表了，导师让伊接着做，伊没有重复出来，但伊不能说师兄的论
文有问题，伊在隐瞒事实的基础上做了更“深入”的研究；导师想要什么结果，伊就能
做出什么结果；毕业前的几个月很多人的实验变得异常顺利，该出来的都出来了。
3.客观造假：无意而为，缺乏常识。
论文中报道一个新的缺失突变，据说伊只挑了一个克隆测序；一个本该重复数
次什么结果；毕业前的几个月很多人的实验变得异常顺利，该出来的都出来了。
的实验没有重复就拿去发文章了。
4.主动造假：急功近利，风雨无阻。
论文中的一张电泳照片来不及重做，借别人的一张差不多的照片顶替；酶切的
时候，有一条带应当完全切掉，但总切不干净，伊用PHOTOSHOP把它涂掉了；论文中的，把
对照组中的一例阳性观察去掉就得到0.041了。
5.积极造假：追逐名利，几近疯狂
伊在一年中发表第一署名的论文50篇；先有论文后有实验记录。
科研体会6
文章写作
1.阅读10篇文献，总结100个常用句型和常用短语。经常复习。
注意，文献作者必须是以英文为母语者，文献内容要与你的专业有关。
这属于平时看文献的副产品。
2.找3-5篇技术路线和统计方法与你的课题接近的文章，精读。
写出论文的草稿。要按照标题、作者、摘要、背景、目的、材料、方法、结果、讨
论、致谢、参考文献、图例、图、表、照片和说明的统一格式来写。这样做的好处是从
它可以方便地改成任何杂志的格式。
3.针对论文的每一部分，尤其是某种具体方法、要讨论的某一具体方面，各找5-8
篇
文献阅读，充实完善。这里讨论的只涉及英文表达，也只推荐给缺乏英文写作经验的人。
4.找到你想投的杂志的稿约，再找2-3篇该杂志的article，按它的格式改写。
注意，每次改写都要先另存为不同的文件名，以免出了问题不能恢复。可
5.找英文高手改。找不到合适的人，就去 http://www.oleng.com.au ，该公司提
供英语论文编辑服务(English correction and improvement，not translation) ，在此
花＄20在这个公司改了一下英文，非常快。
科研体会7
文献管理
1.下载电子版文献时（caj，pdf，html），把文章题目粘贴为文件名。
注意，文件名不能有特殊符号，要把 / : * ? < > | 以及 换行符 删掉。
2.不同主题存入不同文件夹。文件夹的题目要简短，如：PD，LTP,PKC，NO。
3.看过的文献归入子文件夹，最起码要把有用的和没用的分开。
4.重要文献在文件名前加001,002，003编号，然后按名称排列图标，最重要的文献
就排在最前了。
5.复印或打印的文献，用打孔器（￥10-15）打孔，装入硬质文件夹（￥10-20/个）
科研体会8
我们经常会在参考文献的引用上耍一些小聪明，殊不知这些都会降低论文质量。
1.知而不引
故意不引用同行的类似工作，使自己工作看上去“新颖”“领先”。这是一种不道
德行为。实际上审稿的就是同行。
2.断章取义
故意截取作者试图否定的部分来烘托自己的观点。也属不道德行为。
3.引而不确
没有认真看原文，引文错漏。
4.来源不实
某些字句来源不可靠(比如非正式的或非学术的出版物)，且不注明来源。常见于一
些统计数字。
5.盲目自引
不是为了说明自己的工作与前期工作之间的关系，而是单纯为提高自己文章被引用
次数而自引。
故意不引用同行的类似工作，使自己工作看上去“新颖”“领先”。这是一种不道
德。
[印象派 (2-8 16:53, Long long ago)]
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sForum ][登录后回复]18楼
(引用 印象派:如何查找文献的全文(就算国大图书馆也不是所有journal买完的,还是用得上）注：由于大部分院校未能购卖国内外商业医学数据库，如PUBMED、E...)Google其它小功能和特点1 Google能对图像上的文字和PDF进行实时识别！ Google先用OCR软件识别图像中的文字，同时将文字图像大小、出现的位置（如上面、左面距整个图像边缘的像素值）记录下来。搜索时，Google仍以标准程序进行检索，如有匹配的关键词，便在返回的图像上将文字高亮显示，我猜至少这部分工作是实时的。不过，由于OCR本身的限制，因此Google也不敢打保票。另外，对PDF文件，Google也是通过对其进行文字识别而存储的，所谓对PDF文件HTML化，这样以利于全文检索PDF文件内容。目前这可能还是唯此一家。
2 查Flash文件的方法
搜索Flash文件的方法：filetype:swf inurl:swf 3 Google具有智能纠错功能
Google往往会提示它的正确写法，以便于你查找准确，这的确好！
4 1phonebook命令的使用方法：
查询机构
- 知道机构名，想查找电话和地址：phonebook:机构名 城市 州phonebook:机构名 邮政编码
- 知道电话想查机构和地址：phonebook:电话号码（包括地区号）
2、查询住宅电话
- 知道人名查电话phonebook:名（或第一个字母缩写） 姓 城市 州（可选）phonebook:名（或第一个字母缩写） 姓 州phonebook:名（或第一个字母缩写） 姓 地区号phonebook:名（或第一个字母缩写） 姓 邮政编码phonebook:姓 城市 州phonebook:姓 邮政编码
- 知道电话查人名phonebook:电话号码（包括地区号）
如想限定只查询机构，命令为“bphonebook”；如只查住宅电话，命令为“rphonebook”。
与Google的其他搜索命令一样，冒号为英文字符且后面不能有空格。如不想别人在Google上查自己的电话，可在Google PhoneBook Name Removal页面中将记录去除。目前phonebook仅限于查美国的电话。
当然，利用Google还能查人名，或朋友信息。如输入 姓名 @，便能查到一个人的电子邮件信息。
5 查找已过去的信息
查找先前的信息，可利用网页快照功能。对无法访问的站点，也能有效利用快照而获得许多重要信息。
6 不好的用途
由于它的功能太强大，因而病毒、黑客都在利用它。它易于暴露网友的信息、电脑漏洞。
7 Google怎么读？请查字典吧，它源于Googol这个词，金山词霸可以
8 Google能搜索几层链接？
Google是通过对链接的追踪而搜索到全球网页，那么它能搜索多少层网页。如我的个人主页：生物谷 http://bioon.com/,在Google看来，这已是两层了，我再查一下Google对我的个人主页收录情况，发现，Google能搜索到我的主页的下两层，也即Google能搜索四层网页。可以推测Google能分析链接达四层。如果达更深的层，则无异增加Google的负荷，而且许多主页的四层以下多是一此小东东，甚至可忽略。不过，对个人主页则稍吃些亏了
[印象派 (2-8 16:54, Long long ago)]
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(引用 印象派:如何查找文献的全文(就算国大图书馆也不是所有journal买完的,还是用得上）注：由于大部分院校未能购卖国内外商业医学数据库，如PUBMED、E...)Google搜索从入门到精通v4.0http://www.bioguider.com/Article_Show.asp?ArticleID=2189
[印象派 (2-8 16:56, Long long ago)]
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